[发明专利]一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法

说明书

一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法，涉及结核分枝杆菌。1)在直接重复序列上设计一对通用引物扩增所有间隔子；在GyrA保守区域设计一对引物；2)根据43个间隔子序列、GyrA序列设计与之特异杂交的双标记荧光探针，并将探针设计为4组，每组配备相同的荧光基团，通过调整探针长度和/或碱基组成对每条探针的熔点值进行人为控制；3)将荧光探针分布在三个反应管，通过反应管、荧光基团和熔点温度值的组合，每个间隔子分别形成一个三维编码并由软件自动读取结果。只需一步操作，操作简便、特异性高、重复性好、耗时短，价格相对低廉，将为探索和研究我国结核病的流行和传播规律提供有力的工具。

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌，尤其是涉及一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法。

背景技术

结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌，可侵犯全身器官，其中以肺结核最为常见，已成为全球性重大公共卫生问题。结核分枝杆菌复合群包括人型结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。传统上结核分枝杆菌复合群的分类是依据不同种的分枝杆菌在生长、形态、生化特性上的差异进行分类，但这一分类方法已远远不能满足现代结核病预防控制工作的需要。随着科技的进步和结核分枝杆菌基因组测序工作的完成，人们对结核分枝杆菌种间基因的变异情况有了深入的理解。通过对结核分枝杆菌菌株基因型的鉴定，可用于研究结核病暴发流行、传染源的寻找和追踪、耐药菌株的传播和实验室污染等，对于了解结核病的传播模式具有重要的意义。

目前，被广泛应用于结核分枝杆菌的分型方法以Spoligotyping^[1]、MIRU-VNTR^[2]和IS6110-RFLP^[3]三种方法最具有代表性。目前国内外临床上常用的结核分枝杆菌的分型方案通常是多种分型方法联合检测以同时保证临床检测的效率和分型结果的准确性^[4]。首先，采用Spoligotyping分型方法对待检菌株的基因型进行初步划分，图谱不一致的两个菌株则直接归类于不同间隔子寡核苷酸分型簇，即不同的基因型。具有相同图谱的菌株则视为归属于同一分型簇；进而，采用VNTR和IS6110-RFLP分型方法对同种分型簇菌株的基因型再次细分；最后，根据三种分型方法的结果共同确定待检菌株的基因型。因此，Spoligotyping已被公认为结核菌分型的一线方法^[5]。

Spoligotyping分型方法，即间隔寡核苷酸分型方法，是通过识别结核分枝杆菌基因组DNA间隔子序列来划分结核分枝杆菌的类型^[1]。Spoligotyping中的一个重要环节是间隔子PCR产物的识别，传统的Spoligotyping采用固相膜杂交技术来识别间隔子PCR产物。传统的固相膜杂交技术虽然具备检测流程成熟及试剂成本低廉的优点，但是需要较多的人工操作、检测时间长，并且样本检测通量也不能够满足临床需要。这两个技术瓶颈严重阻碍了Spoligotyping的临床推广，对此科学工作者提出了采用基因芯片^[6,7]、编码微球^[8,9]和质谱检测^[10,11]等技术来替代固相膜杂交技术，目前已报道的Spoligotyping改进技术虽然提高了通量，检测时间也大大缩短，但是这些技术均未摆脱PCR开管后处理的检测模式，容易造成PCR产物的污染，并且由于需要一些大型仪器，难以在临床上得到广泛应用。因此，开发更为快速、简便、高通量的间隔子PCR产物识别技术成为了Spoligotyping发展的关键。

综上所述，开发出一种新型、高通量、易用且标准化的结核菌溯源新技术将对探索和研究我国结核病的流行和传播规律提供有力工具，为建立结核病监测网络，实现结核菌感染的实时监控和传播途径的及时确认提供技术支撑，对于结核病的防控具有重要的意义和价值。

参考文献：