[发明专利]一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法

权利要求书

1.一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法，所述方法不用于疾病诊断，其特征在于包括如下步骤：

(1)引物设计：在结核分枝杆菌基因组中高度同源的直接重复序列上设计一对通用引物，并利用这对通用引物扩增出所有间隔子；在结核分枝杆菌管家基因GyrA序列中选取保守区域设计一对扩增引物，引物序列如下所示：

DR-F：5'-3'CCGAGAGGGGACGGAAAC，

DR-R：5'-3'GGTTTTGGGTCTGACGAC，

GyrA-F1：5'-3'TGAGGACCAGTCTAGCGATC，

GyrA-R1：5'-3'ACGTAATAGCGGATCAGCTG；

除了设计一对通用引物用于扩增所有间隔子序列外，还设计一对引物用于扩增GyrA基因保守区域作为内控信号，以保证所检样品中含有结核菌基因组DNA，并且浓度达到检测要求，以确保体系的有效性及分型结果的可靠性；

(2)探针设计：根据结核分枝杆菌复合群43个间隔子的DNA序列设计43条能够与之特异杂交的双标记荧光探针，在GyrA引物扩增产物选取保守区域设计一条与之特异杂交的双标记荧光探针；同时将探针设计为4组，每组的探针配备相同的荧光基团和淬灭基团作为一个检测通道，并通过调整探针的长度和/或碱基组成对每条探针的熔点温度值进行人为控制，使得同一检测通道内针对不同间隔子序列的荧光探针的熔点温度值都间隔合适的差值，探针序列及探针修饰如下所示：

(3)三维编码：将43个间隔子对应的双标记荧光探针分布在三个反应管中，通过所在反应管、荧光基团和熔点温度值的组合，每个间隔子形成一个与之对应的三维编码，43个间隔子对应43个三维编码；三个反应管中均含有GyrA双标记荧光探针，GyrA基因对应3个三维编码；43个间隔子及GyrA基因对应的三维编码如下所示：

(4)软件判读：当PCR扩增产物中存在目标序列时，相应的双标记荧光探针就能与之杂交形成特征的熔解曲线峰，自动判读软件首先判读GyrA基因对应的三维编码内是否具有熔点温度值，接着依次根据每个间隔子对应的三维编码进行判读，若对应的三维编码中有熔点值，则该间隔子存在，表示为“1”；若无熔点值，则该间隔子缺失，表示为“0”；最后，软件按照间隔子1→间隔子43的顺序输出待检结核分枝杆菌的基因型。

2.如权利要求1所述一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法，其特征在于在步骤(2)中，所述43条能够与之特异杂交的双标记荧光探针是与43个间隔子的DNA序列能够特异杂交的，并形成特征的熔解曲线峰。

3.如权利要求1所述一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法，其特征在于在步骤(2)中，所述检测通道表示仪器对不同荧光基团的分辨能力，设计的检测通道为4个，用于检测43个间隔子。

4.如权利要求1所述一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法，其特征在于在步骤(2)中，所述荧光基团的类型包括但不限于：FAM、HEX、ROX、CY5；用于以上荧光基团的淬灭基团包括BHQ、ECLIPSE或TAMAR。

5.如权利要求1所述一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法，其特征在于在步骤(2)中，同一检测通道中相邻探针的熔点温度值的间隔差值为4～10℃。