[发明专利]一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法和应用。

背景技术

人类健康、能源、环境等领域的重大需求牵引着合成生物学的迅猛发展。合成生物技术在合成重要产品、生产清洁能源、维护人类健康等方面均取得了令人瞩目的成果。利用合成生物技术构建菜油甾醇人工细胞可以弥补化学法和酶促法的不足，且生产过程绿色清洁，有很大的优势。将基因原件(启动子、转录调控区域、核糖体结合位点、开放阅读框、终止子等)依据工程化目标需要，有机重构和连接起来，便形成了功能基因模块。通过对已有生物网络加以利用，同时引入新的功能基因模块，表达出天然细胞不能合成或含量极低的产物。

菜油甾醇作为甾体类药物的关键前体，它的合成具有重要意义。菜油甾醇作为一般的植物甾醇是在植物中提取的，但植物提取周期长，副产物和污染较大。微生物中目前尚无菜油甾醇作为产物的合成报道，但有以此为中间产物最终合成黄体酮和氢化可的松的研究。

目前人们对解脂酵母的研究愈来愈多，解脂酵母作为一种非常规的安全酵母被更多的拿来生产。解脂酵母在生产柠檬酸，脂肪酸以及番茄红素上都有巨大的优势。由于解脂酵母中的油滴比酿酒酵母大，所以可以更好的容纳一些疏水产品，这些疏水产品储存在油滴中减轻对细胞的毒害作用。解脂酵母可以将很多物质作为自己的碳源，并且在各种碳源中都能获得较大的生物量。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组耶氏解脂酵母菌株，使得所述菌株能够应用于菜油甾醇的生物合成中，并保持较高产量，同时提供所述菌株的构建方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种重组耶氏解脂酵母菌株，基因组包含SEQ ID NO:1-3任意一项所示的核苷酸序列。

本发明将包含蟾蜍、水稻或褐家鼠来源的基因dhcr7基因的核苷酸序列利用耶氏解脂酵母自身的同源重组，整合到耶式解脂酵母基因组erg5位点上，获得所述重组耶氏解脂酵母菌株，具体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-3，三者区别在仅于dhcr7基因来源不同，依次为褐家鼠来源、水稻来源和蟾蜍来源。

同时，本发明还提供了所述重组耶氏解脂酵母菌株的构建方法，包括

步骤1、将SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列连接到由启动子和终止子组成的表达盒中，获得单基因表达盒；

步骤2、将SEQ ID NO:7所示、SEQ ID NO:8所示和SEQ ID NO:9的核苷酸序列通过OE-PCR连接，获得片段1，SEQ ID NO:8所示和SEQ ID NO:9的核苷酸序列均位于SEQ ID NO:7所示核苷酸序列下游，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列位于SEQ ID NO:8所示核苷酸序列下游；

步骤3、将SEQ ID NO:10所示和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列通过OE-PCR连接，获得片段2，SEQ ID NO:11所示核苷酸序列位于SEQ ID NO:10所示核苷酸序列下游；

步骤4、将单基因表达盒、片段1以及片段2采用醋酸锂法进行耶式解脂酵母转化，然后采用SC-drop培养基进行筛选，获得所述重组耶氏解脂酵母菌株；

其中，步骤1、步骤2和步骤3不分先后顺序。

步骤1中，SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示以及SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列即为经过优化后的褐家鼠来源、水稻来源和蟾蜍来源的dhcr7基因。作为优选，步骤1包括：

步骤1.1、在SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列两端加上BsaI酶切位点，获得外源靶基因，并连接到载体上；

选用耶式解脂酵母内源启动子EXP1和终止子XPR2，在两者之间构建一对反向BsaI酶切位点组成表达盒，同时在表达盒两端加上NotI酶切位点，并连接到载体上；

步骤1.2、对连接有外源靶基因的载体和连接有表达盒的载体进行BsaI酶切，将外源靶基因连接到表达盒上，而后进行NotI酶切，获得单基因表达盒，序列如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。单基因表达盒具体的合成示意图见图1，所述载体优选为pUC57-simple质粒，该质粒可通过金斯瑞公司购买获得。