[发明专利]一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种重组耶氏解脂酵母菌株，其特征在于，基因组erg5位点上整合有SEQ ID NO:12-14任意一项所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述重组耶氏解脂酵母菌株在生产菜油甾醇中的应用。

3.权利要求1所述重组耶氏解脂酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括：

步骤1、将SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列连接到由启动子和终止子组成的表达盒中，获得单基因表达盒；

步骤2、将SEQ ID NO:7所示、SEQ ID NO:8所示和SEQ ID NO:9的核苷酸序列通过OE-PCR连接，获得片段1，SEQ ID NO:8所示和SEQ ID NO:9的核苷酸序列均位于SEQ ID NO:7所示核苷酸序列下游，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列位于SEQ ID NO:8所示核苷酸序列下游；

步骤3、将SEQ ID NO:10所示和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列通过OE-PCR连接，获得片段2，SEQ ID NO:11所示核苷酸序列位于SEQ ID NO:10所示核苷酸序列下游；

步骤4、将单基因表达盒、片段1以及片段2采用醋酸锂法进行耶式解脂酵母转化，然后采用SC-drop培养基进行筛选，获得所述重组耶氏解脂酵母菌株；

其中，步骤1、步骤2和步骤3不分先后顺序。

4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤1包括：

步骤1.1、在SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列两端加上BsaI酶切位点，获得外源靶基因，并连接到载体上；

选用耶式解脂酵母内源启动子EXP1和终止子XPR2，在两者之间构建一对反向BsaI酶切位点组成表达盒，同时在表达盒两端加上NotI酶切位点，并连接到载体上；

步骤1.2、对连接有外源靶基因的载体和连接有表达盒的载体进行BsaI酶切，将外源靶基因连接到表达盒上，而后进行NotI酶切，获得单基因表达盒，序列如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。

5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，所述载体为pUC57-simple质粒。

6.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤2包括：

采用SEQ ID NO:15-20所示核苷酸序列为引物，通过OE-PCR将SEQ ID NO:7-9所示核苷酸序列连接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段，连入载体，进行NotI酶切，获得片段1，如SEQ ID NO:21所示。

7.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤3包括：

采用SEQ ID NO:22-25所示核苷酸序列为引物，通过OE-PCR将SEQ ID NO:10-11所示核苷酸序列连接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段，连入载体，进行NotI酶切，获得片段2，如SEQ ID NO:26所示。

8.根据权利要求6或7所述构建方法，其特征在于，所述载体为pEASY-Blunt质粒。

9.权利要求3-8任意一项所述构建方法构建的重组耶氏解脂酵母菌株。

10.一种生产菜油甾醇的方法，其特征在于，将权利要求1或权利要求9所述解脂酵母菌株经种子培养基活化后接种于发酵培养基中培养，培养后收集菌体细胞提取菜油甾醇。

11.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述种子培养基为SC-drop培养基。