[发明专利]质粒型载体、基因启动子活性的检测方法、及分析试剂盒

权利要求书

1.不以获得下述细胞的主体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的的、基因启动子活性的体外检测方法，所述方法具备：

将下述的质粒型载体导入细胞，

伴随上述质粒型载体中含有的基因启动子的活性而上述质粒型载体可扩增地，在上述细胞分裂增殖的条件下培养上述细胞，以及

测定在上述培养的细胞内的，上述质粒型载体中含有的报告子基因的表达量，

所述质粒型载体，其具备：

基因启动子、以及

第1基因，其编码配置在上述基因启动子之下游的，用于可视化上述基因启动子的活性的报告子蛋白质、以及

第2基因，其编码配置在上述基因启动子之下游的复制起始蛋白质、以及

内部核糖体结合序列，其配置在上述第1基因和上述第2基因之间、以及

转录终止信号序列，其编码用于终止上述第1基因和上述第2基因的转录的信号、以及

复制起始序列，其被上述复制起始蛋白质识别，且

将所述第1基因、第2基因构成双顺反子，由同一所述基因启动子启动，以使报告子基因和内部核糖体结合序列与复制起始蛋白质基因被转录成单一的mRNA。

2.权利要求1所述的方法，其中上述第1基因是萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、一氧化氮合成酶基因、黄嘌呤氧化酶基因、蓝色荧光蛋白质基因、绿色荧光蛋白质基因、红色荧光蛋白质基因、或者重金属结合蛋白质基因。

3.权利要求1所述的方法，其中

上述第2基因是猿猴病毒40的大T抗原基因，

上述复制起始序列是猿猴病毒40的复制起始序列。

4.权利要求3所述的方法，其中上述大T抗原基因是由SEQ ID NO:1所示的碱基序列组成的大T抗原基因。

5.权利要求3所述的方法，其中上述大T抗原基因由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或者SEQ ID NO:4所示的碱基序列组成的变异型的大T抗原基因。

6.权利要求1所述的方法，其中

上述第2基因是爱泼斯坦-巴尔病毒的EBNA-1基因，

上述复制起始序列是爱泼斯坦-巴尔病毒的复制起始序列。

7.权利要求1所述的方法，其中

上述第2基因是小鼠多瘤病毒的大T抗原基因，

上述复制起始序列是小鼠多瘤病毒的复制起始序列。

8.权利要求1所述的方法，其中上述基因启动子是在疾病的早期活化的基因启动子、或者，响应环境刺激而活化的基因启动子。

9.权利要求1所述的检测方法，其中上述细胞是人或猴来源的细胞。

10.权利要求1所述的检测方法，其中上述细胞是小鼠或大鼠来源的细胞。

11.权利要求1所述的检测方法，其中

上述报告子基因是萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、蓝色荧光蛋白质基因、绿色荧光蛋白质基因、或者红色荧光蛋白质基因，

上述测定是作为上述表达量，利用光学检测装置测定上述报告子基因的翻译产物的发光量或荧光量。

12.权利要求1所述的检测方法，其中

上述报告子基因是一氧化氮合成酶基因、或者黄嘌呤氧化酶基因，

上述测定是，作为上述表达量，将由上述报告子基因的翻译产物生成的活性氧量利用电子自旋共振装置测定。

13.权利要求1所述的检测方法，其中

上述报告子基因是重金属结合蛋白质基因，

上述测定是，作为上述表达量，将与上述报告子基因的翻译产物结合的重金属量利用磁共振成像装置、核医学诊断装置、或者X射线计算机断层摄影装置测定。

14.权利要求1所述的检测方法，其中上述质粒型载体通过由上述质粒型载体中含有的第2基因的表达而合成的复制起始蛋白质与上述质粒型载体中含有的复制起始序列结合而自身扩增。

15.权利要求1所述的检测方法，其中上述细胞是处于在疾病早期的前疾病化状态的细胞。

16.权利要求1所述的检测方法，其中上述基因启动子可在上述细胞分裂增殖的条件下具有活性。