[发明专利]基于DNA标签-PCR快速检测TGEV早期感染的方法

权利要求书

1.一种基于DNA标签-PCR快速检测TGEV早期感染的方法，其特征在于，包括以下步骤：

Step1、制备TGEV特异性探针标记的磁性微粒MMP，所述TGEV特异性探针序列为：

5’NH2-T15CAAATATTTCGTTTAGTTCGAGTTGGTGTCCG；

Step2、制备TGEV特异性信号探针标记的纳米金颗粒AuNPs，所述特异性信号探针序列为：

5’SH-T15CGAATAGGAAGACTAGGCACGTTGACTTACTTGTACAGCTCG；

Step3、TGEV探针标记的MMP和AuNP与TGEV病毒RNA的杂交反应及目标DNA标签的洗脱：

3a、取500μl TGEV血清样本和100μl裂解液至1.5ml离心管中，煮沸15min使病毒RNA释放，4℃、12000rpm离心5min，取上清，所述裂解液：10mmol/L Tris-HC1，1mmol/L EDTA，15mmol/L NaCl，0.5％SDS，pH 8.0；

3b、在上述裂解上清中加入100μl、pH4.8的NaAc，再加入等体积异丙醇混匀，沉淀30min，12000rpm离心5min，去上清，加500μl75％乙醇洗涤2次，10μl TE缓冲液重悬病毒核酸，所述TE缓冲液：1M Tris buffer pH 8.0，1mM EDTA；

3c、取2μl标记后的磁性微粒MMP和10μl病毒核酸，加入17μl杂交缓冲液混匀，40℃杂交30min，杂交完毕后加入2μl标记后的纳米金颗粒AuNPs，混匀后50℃杂交40min，获得AuNP-MMP复合物，所述杂交缓冲液：5×SSC，0.1％Tween-20，0.2％SDS；

3d、每次取1ml TE缓冲液，洗2-3次，去除残留的杂交缓冲液、未结合的探针和DNA标签；

3e、用100μl新配置的DTT洗脱液与AuNP-MMP复合物在室温下作用10min，磁分离3min后取上清液，所述DTT洗脱液：0.5mol/L DTT，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5；

3f、加入1/10体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，沉淀30min；

3g、4℃、12000rpm离心10min，弃上清，加入75％乙醇洗涤两次；

3h、4℃、12000rpm离心10min，弃上清，自然风干，加入3μl的H₂O溶解DNA标签；

Step4、PCR检测与TGEV特异结合的DNA标签：

4a、以pEGFP-N1为模板，

上游引物F：ATAGCGGTTTGACTCACGGG，

下游引物R：CCCTTTGACGTTGGAGTCCA，

采用50μl体系：10×buffer 5μl，dNTP 4μl，上游引物1μl，下游引物1μl，Taq酶0.5μl，模板2μl，ddH₂O 36.5μl，

反应程序如下：94℃预变性4min；94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸105s，共30个循环；72℃延伸10min；

将pEGFP-N1扩增产物切胶回收，并浸泡到TE中4℃保存；

4b、以pEGFP-N1扩增产物和DNA标签为模板，

上游引物：AGCAGAAGAACGGCATCAAG，

下游引物：GCCATCTTGGCCAGATCCT，

采用25μl体系：10×buffer 2.5μl，dNTP2μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，Taq酶0.2μl，pEGFP-N1扩增产物0.5μl，纯化的DNA标签0.5μl，ddH₂O 18.3μl，

反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性40s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min；

取25μl PCR扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳并使用凝胶成像仪观察和记录结果。