[发明专利]基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法。

背景技术

促卵泡素（Follicle stimulating hormone， FSH）是脑腺垂体分泌的对卵巢卵泡生长、发育、分化和成熟起重要作用的生殖类激素。其为生物大分子，不能透过细胞膜，必须与促卵泡素受体(follicile stimulating hormone receptor，FSHR)结合才能发挥其生物学功能。FSHR是G蛋白偶联受体超家族的成员之一，其受体蛋白肽链在功能和结构上可以分为三个部分：胞内域、跨膜域和胞外域，即4个包质区、7个跨膜疏水区和N端的3个环状区组成的细胞外区。促卵泡素对雌性动物的繁殖性能具有重要的作用。然而，促卵泡素必须与促卵泡素受体结合才能发挥作用。所以，促卵泡素受体的质量和数量决定促卵泡素生物学功能是否充分发挥。或者说，FSHR含量的多少可能与雌性动物的繁殖性能有一定的作用。

实时荧光定量PCR不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强、有效解决了PCR污染的问题、自动化程度高等特点。山羊FSHR基因已有研究表明对山羊的繁殖性能有一定的影响，但其生物学机理扔不清楚。我们应用实时荧光定量PCR技术，建立山羊FSHR基因在不同组织中的表达谱，对于阐明FSHR基因表达的作用机理具有一定的指导作用。

发明内容

本发明的目的是：提供一种基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法，它具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强、有效解决了PCR污染的问题、自动化程度高等特点，比采用其它方法来建立组织表达谱适应性更强。

本发明是这样实现的：基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法，采用Trizol法分别提取已屠宰的发情期产单羔和产双羔母羊的5种组织的总RNA，所述的5种组织包括下丘脑、垂体、卵巢、输卵管和子宫；并对提取的总RNA进行cDNA的反转录合成；以上述cDNA为模板，分别对FSHR和GAPDH进行常规PCR扩增；FSHR上游引物的序列为5’- CGAGTCATCCCAGAAGGAG-3’， FSHR下游引物的序列为5’- GGCAGGTTGGAGAACACATT- 3’； GAPDH上游引物的序列为5’ -CTGACCTGCCGCCTGGAGAAA -3’， GAPDH:下游引物的序列为5’ -GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTT- 3’； 回收相应条带并与T-载体连接，转化DH5α感受态细胞，将鉴定为阳性的重组质粒进行测序，并将获得的重组质粒进行10倍比稀释后，将其作为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，获得标准曲线；荧光定量PCR每个样品，并用ddH₂O做阴性对照；采用2^-△△Ct定量分析方法对山羊FSHR基因在发情期不同组织进行差异表达量分析，构建组织表达谱。

所述的对对FSHR和GAPDH进行常规PCR扩增时，PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min，34个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；反应体系为20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL, DNA模板2 μL，上、下游引物各1.5 μL，加水至20 μL。

所述的回收相应条带并与T-载体连接，具体反应体系如下：胶回收的PCR产物3 μL；pUCm-T载体1 μL；10×Ligation Buffer 1 μL；50%PEG 4000 μl；Sterilized ddH₂O 3 μl；T4 DNA Ligation 1 μL；混匀，16 ℃连接过夜。

所述的转化DH5α感受态细胞的转化步骤如下：取100 μL感受态细胞，置于冰上，完全解冻后将细胞均匀悬浮；将上述的连接液全部加入感受态细胞中混匀，冰上放置30 min；42℃水浴热激90 s，冰上放置15～20 min；加400 μL SOC培养基，37℃200～250 rpm振荡培养1小时；室温下4000rpm离心5 min，用枪头吸掉400 μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；将细菌涂布在预先用20 μL 100Mm IPTG和100 μL 20mg/ml X-gal涂布的氨苄青霉素平板上；平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。