[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物学检测技术领域，涉及一种鉴别诊断PRRSV TJM- F92株、美洲型经典株和变异株的引物及试剂盒及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸道综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) 俗称“猪蓝耳病”，是由PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的传染病，是目前引起猪场繁殖障碍的主要疫病之一。该病首先暴发于美国，随后传播到世界各地，给世界养猪业造成巨大的经济损失。在中国，郭宝清等于1996年首次从北京地区暴发流行的流产胎儿体内分离到PRRSV，从而证实了该病在我国的存在。

近年来，PRRSV在国内的流行过程中不断演化重组，新流行毒株越来越多，这些变化带来的是病毒防控的难度持续增加与致病力的持续增强。经过近20年的进化，使得目前国内流行毒株已经不单单是美洲型PRRSV经典株。2006 年发生于我国的高致病性 PRRS，造成国内大量高致病性PRRSV的流行毒株（变异株）出现，该类型毒株大部分 NSP2 基因缺失 90个碱基，目前已经占据了国内分离毒株的 70%以上，而且其自身还在继续变异。同时，不同来源的PRRSV基因的重组导致大量新毒株和中间毒株产生，包括野毒间的重组毒株、疫苗毒株和野毒株的重组毒株、以及疫苗毒株演化而来的毒株，最终导致PRRSV新毒株层出不穷。

由于PRRSV病毒分离培养方法费时费力，目前已经报道的PCR方法只能区分1-2种类型的PRRSV。为更准确地开展病原学调查和研究，获取更多的病原信息，研究开发可以快速、准确鉴别PRRSV经典毒株与不同类型变异毒株的 RT-PCR 检测方法势在必行。

迄今，关于PRRSV的检测，已有专利技术公开发布，但这些技术和本专利申请的内容存在较大的区别。简要情况如下：

（1）中国专利申请号为200710076592.5，公开了一种用于检测高致病性PRRSV核苷酸片段的引物和探针序列，序列为：

上游引物PVpf:5’-CCCAAGCTGATGACACCTTT-3’

下游引物PVpr: 5’-AATCCAGAGGCTCATCCTGGT-3’

探针PVpb: 5’-CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA-3’

该方法使用荧光定量PCR方法可检测样品中是否含有高致病性PRRSV，但无法检测是否含有经典株。

（2）中国专利申请号为200810032141.6,公布了一种高致病性PRRSVRT-PCR快速检测试剂盒，引物序列为：

PrimerP1：5’-CGTAGAACTGTGACAACAAC-3’

PrimerP2：5’-TGAGTATTTTGGGCGTGTGAT-3’

该方法使用一步法PCR方法可检测样品中是否含有高致病性PRRSV，无法判断是否含有PRRSV经典株。

（3）中国专利申请号为200910077704.8公开了PRRSV经典株和变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法。

检测PRRS经典株的引物和探针为：

上游引物PRRSV-F2：5’-CGCACCAGATGGRACCTACTT-3’

下游引物PRRSV-R3：5’-ACGGTGTTCAGTGAGGGCTTT-3’

探针PRRSV-P: 5’-CCAGTCAACGCAGCG-3’

检测PRRS经典株的引物和探针为：

上游引物H-PRRSV-F2：5’-AGTGGGTCGGCACCAGTT-3’

下游引物H-PRRSV-R12：5’-GCAGACAAATCCAGAGGCTCAT-3’

探针H-PRRSV-P: 5’-CGTAGAACTGTGACAAC-3’

该方法可以一次反应鉴别PRRSV经典株和变异株，但无法区分样品中是否含有PRRSVTJM-F92株。

（4）中国专利申请号201310189880.7公开了检测猪蓝耳病流行病毒与HP-PRRS病毒天津株的RT-PCR试剂盒。引物序列为：

上游引物Pa：5’-CGTCCGTGTCATCAAGCAGCTC-3’

下游引物Pc：5’-AAAAGAGGCACAATAGAGTAAAAGG-3’