[发明专利]一种甲酸脱氢酶的重组菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌及其应用。

背景技术

2,3-丁二醇是一种重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工、食品、燃料及航空航天等领域，具有生物降解性。2,3-丁二醇含有两个手性碳原子，因此具有三种旋光异构体(分别为R,R-2,3-丁二醇、S,S-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇)。R,R-2,3-丁二醇除了具有上述用途以外，还是优良的抗冻剂，也是合成手性试剂、手性配体的重要中间体，在手性药物和天然产物的合成中也有潜在的重要应用。目前，研究发现能够代谢合成R,R-2,3-丁二醇的微生物寥寥无几，而多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa，前称Bacillus polymyxa)是其中唯一具备工业化生产R,R-2,3-丁二醇潜力的微生物。P.polymyxa中的极少数菌株能够产菊粉酶，可以直接利用能源植物菊芋菊粉(菊糖)一步法发酵制备高附加值的R,R-2,3-丁二醇。其中辅酶NADH作为还原当量起着关键的作用，其含量的高低直接影响到2,3-丁二醇的产量，这些NADH主要是由菊粉氧化途径合成再生的。因此，适当提高胞内NADH浓度及NADH/NAD比例，有望提高2,3-丁二醇合成浓度。

由于辅酶NADH结构复杂、不稳定和价格昂贵等缺点，在工业生产中不断添加辅酶NADH显然是不可行的，因而辅酶NADH的再生就成为降低生产成本的重要环节。近年来，甲酸脱氢酶(FDH)辅酶再生系统引起了人们的广泛关注，并成功应用于L-叔亮氨酸的工业生产。甲酸脱氢酶属于D-2-羟基酸脱氢酶类，广泛存在于甲醇利用型的细菌和酵母中。它可以在催化甲酸转化为二氧化碳的同时将NAD⁺还原成NADH。本发明选择Candida boidinii作为分子生物学操作的出发菌株，通过PCR技术从该菌株的基因组上扩增得到了甲酸脱氢酶的编码基因(fdh基因)，Paenibacillus polymyxa ZJ-9作为宿主，成功构建了能够高效表达甲酸脱氢酶的重组菌，提高了R,R-2,3-丁二醇的产量，减少了副产物甲酸的含量，有良好的工业应用前景。

发明内容

发明目的：本发明的第一个目的是提供一种用于扩增甲酸脱氢酶的引物对。

本发明的第二个目的是提供一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌。

本发明的第三个目的是提供一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌的构建方法。

本发明的第四个目的是提供表达一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌在制备R,R-2，3-丁二醇方面的应用。本发明的第五个目的是提供一种R,R-2，3-丁二醇的生产方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种用于扩增甲酸脱氢酶的引物对，所述引物对包括两组：第一组引物对如下：

F1：5′-AGGCCGGGGCATATGGGAAACA-3′

R1：5′-TAAGACTAAAACGATCTTCATAAGCTTCTGTTATTAATTCTT-3′

第二组引物对如下：

F2：5′-AAGAATTAATAACAGAAGCTTATGAAGATCGTTTTAGTCTTA-3′

R2：5′-CCGGGATCCTTATTTCTTATCGTGTTTACC-3′。

一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌，它是以B.subtilis 168基因组为模板以第一组引物对进行PCR扩增得到获得的P43启动子片段，以假丝酵母Candida boidinii的基因组为模板以第二组引物对PCR扩增得到甲酸脱氢酶基因片段fdh，再将获得的P43启动子片段与甲酸脱氢酶基因片段进行重叠PCR，将重叠PCR获得的产物与质粒pMA5在T4连接酶作用下连接得到重组质粒pMA5-P43-fdh，最后将重组质粒pMA5-P43-fdh电转入P.polymyxa ZJ-9中获得重组菌P.polymyxa GX-1。

一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌的构建方法，包括以下步骤：

1)以B.subtilis 168基因组为模板设计第一组引物对，如上述序列所示，PCR扩增得到P43强启动子片段，切胶回收备用；

2)以假丝酵母Candida boidinii的基因组为模板，设计第二组引物对，如上述序列所示，PCR扩增得到甲酸脱氢酶基因片段fdh；

3)将获得的P43强启动子片段与甲酸脱氢酶基因fdh进行重叠PCR；