[发明专利]一种甲酸脱氢酶的重组菌及其应用

权利要求书

1.一种用于扩增甲酸脱氢酶的引物对，其特征在于，所述引物对包括两组：第一组引物对如下：

F1：5′-AGGCCGGGGCATATGGGAAACA-3′

R15′-TAAGACTAAAACGATCTTCATAAGCTTCTGTTATTAATTCTT-3′

第二组引物对如下：

F2：5′-AAGAATTAATAACAGAAGCTTATGAAGATCGTTTTAGTCTTA-3′

R2：5′-CCGGGATCCTTATTTCTTATCGTGTTTACC-3′。

2.一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌，其特征在于，它是以B.subtilis 168基因组为模板以权利要求1的第一组引物对进行PCR扩增得到获得的P43启动子片段，以假丝酵母Candida boidinii的基因组为模板以权利要求1的第二组引物对PCR扩增得到甲酸脱氢酶基因片段fdh，再将获得的P43启动子片段与甲酸脱氢酶基因片段进行重叠PCR，将重叠PCR获得的产物与质粒pMA5在T4连接酶作用下连接得到重组质粒pMA5-P43-fdh，最后将重组质粒pMA5-P43-fdh电转入P.polymyxa ZJ-9中获得重组菌P.polymyxa GX-1。

3.权利要求1所述的一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以B.subtilis 168基因组为模板设计第一组引物对，如权利要求1序列所示，PCR扩增得到P43强启动子片段，切胶回收备用；

2)以假丝酵母Candida boidinii的基因组为模板，设计第二组引物对，如权利要求1序列所示，PCR扩增得到甲酸脱氢酶基因片段fdh；

3)将获得的P43强启动子片段与甲酸脱氢酶基因fdh进行重叠PCR；

4)经限制性内切酶BamH I和Nde I双酶切，与经过同样双酶切的质粒pMA5在T4连接酶的作用下进行连接得到重组质粒pMA5-P43-fdh；

5)将重组质粒pMA5-P43-fdh电转入P.polymyxa ZJ-9，获得重组菌P.polymyxa GX-1。

4.权利要求2所述的一种外源表达甲酸脱氢酶的重组菌在制备R,R-2，3-丁二醇方面的应用。

5.一种R,R-2，3-丁二醇的生产方法，其特征在于，以权利要求2所述的重组菌P.polymyxa GX-1在发酵罐中发酵获得。

6.权利要求5所述的一种R,R-2，3-丁二醇的生产方法，其特征在于，所述发酵培养条件为：温度30℃，通气量1vvm，装液量4L，接种量8％，前22h转速为300r/min，后22h调为200r/min，pH调控策略为：发酵初期不控发酵液pH，待发酵过程中随着pH值降到6.0以下时，用4M NaOH调pH为6.0。

7.权利要求5所述的一种R,R-2，3-丁二醇的生产方法，其特征在于，所述发酵过程中活化培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂10～20g/L，pH 7.0；种子培养基：菊粉20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏3g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0；发酵培养基：菊粉75g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄ 3.09g/L，MnSO₄·H₂O 0.001g/L，NH₄Cl 0.93g/L，FeSO₄·7H₂O 0.04g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.001g/L，pH 6.0。