[发明专利]检测PIK3CA基因突变的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测PIK3CA基因突变的试剂盒，还涉及利用该试剂盒在非疾病诊断中检测PIK3CA基因突变的方法。

背景技术

在我国，结直肠癌的发病率已跃居恶性肿瘤的第四位，而且发病率逐年上升，已成为严重威胁我国人民健康的主要肿瘤之一。近年来，手术治疗、化学药物疗法、放射线疗法飞速发展，却未能明显提高结直肠癌患者的5年生存期。近年来，随着以抗表皮生长因子受体(Epidermal growth factor Receptor，EGFR)为代表的分子靶向疗法的兴起，不仅丰富和发展了结直肠癌的综合治疗方式，同时使结直肠癌患者的治疗预期有了一定的改善。

EGFR表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中常过表达，EGFR的过表达和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。EGFR下游的信号转导通路主要有两条：一条是Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路，而另一条是PI3K/Akt/mTOR通路。

PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，本身具有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性，调节细胞增殖、存活、迁移、调亡和细胞周期等多种生物学功能。PIK3CA基因是一种癌基因，一种脂质激酶编码基因，是逆转录病毒V-P3K癌基因在细胞内的同系物，定位于3q26.3，编码Ⅰ类磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的p110催化亚单位，即PI3Kp110α。在PIK3CA基因的突变中，约80％的突变热点位于第9号外显子和第20号外显子中，造成了PI3K蛋白中相应螺旋区和激酶区氨基酸的改变。这些氨基酸的改变引起PI3K蛋白中催化亚基p110α异常激活。另外，与GTP结合的RAS蛋白直接与p110a结合，同时具有磷酸化酪氨酸酶残基的生长因子受体、连接蛋白、PI3Ks的调节亚单位p85也参与其中，共同通过复杂的机制过度活化PI3Ks，活化的PI3Ks进一步激活下游Akt等信号分子，活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等，最终导致肿瘤的发生。研究发现，肿瘤患者中的PI3K基因常被异常激活，其突变体的产生会使患者对西妥昔单抗、帕尼单抗、拉帕替尼(Lapatinib)产生耐药性。PI3K基因突变在其它癌症中也都有报道，包括乳腺癌、脑癌、肝癌、胃癌和肺癌，其中PI3K在乳腺癌的突变率可高达40％。

各种来源的癌症组织是检测突变的最佳样本，但部分中晚期患者难以得到较佳的病理组织，检测血浆中来自肿瘤的DNA是否有突变是一种趋势。肿瘤患者的血浆循环DNA，亦称非细胞游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)中包含肿瘤起源的DNA，与原发肿瘤基因组DNA具有相同的遗传特征。肿瘤cfDNA包括来源于正常细胞的野生型DNA和肿瘤细胞DNA，多项研究表明肿瘤患者血浆中可以检测到与自身肿瘤相一致的DNA突变。

因此，检测组织或血浆PIK3CA基因突变对于癌症早期发现与指导病人临床用药，具有重要的参考价值。

目前检测基因突变的方法主要有以下几种：

(1)直接测序法。直接测序法的原理是：首先针对突变位点设计引物(每个基因设计一对引物，引物所对应的产物尽可能的包含突变位点所在的位置)，然后通过简单PCR扩增获得目的基因产物，最后对PCR产物进行测序并且对测序结果进行初步分析。初步分析完成后，对一些可能的突变样品的PCR产物，需要对目的条带进行切胶回收；回收后的PCR产物连接克隆载体；挑选阳性克隆测序并对测序结果进行分析。此过程比较繁琐、耗时长，而且由于测序方法本身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20％的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临床中的应用与大量的临床样本分析。

(2)变性高效液相色谱法(denaturing high-performance liquid chromatograph，DHPLC)。该方法的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将他们分离开。由于杂合双链在突变位点处出现错配，更易于形成“Y”形结构，与固定相的结合能力降低，因此杂合DNA链要比纯合DNA链优先洗脱出来，通过洗脱峰的不同判断有无突变存在。DHPLC可检测出含有单个检测的突变、插入或者缺失的异源双链片段。该法对已知和未知的突变位点均可以检测，敏感性在5％左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认其具体未知，最终还需测序确认。