[发明专利]检测PIK3CA基因突变的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有针对PIK3CA基因突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针。

2.根据权利要求1所述检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于：所述锁核酸修饰的特异探针的核苷酸序列为CTC+TCT+GAA+ATC+ACT+GAGCAGGAG-PO₄或CCAC+CA+TGA+TG+TGCATCATTC-PO₄，其中“+”后的T，G，A或C为锁核酸修饰碱基。

3.根据权利要求1所述检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含检测PIK3CA基因突变的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.7。

4.根据权利要求1所述检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、dNTPs、Eva Green和二氯化镁。

5.根据权利要求4所述检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中各组分的终浓度如下：1×PCR buffer、2.5mM MgCl₂、dNTP 250μM、引物250nM、探针500nM、1×EVE GREEN、DNA聚合酶1U和DNA模板2-20ng。

6.权利要求1-5任一项所述检测PIK3CA基因突变的试剂盒在非疾病诊断中检测PIK3CA基因突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a.设计检测PIK3CA基因突变的引物和针对PIK3CA基因突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针；

b.从待测样品中提取模板DNA，然后利用步骤a得到的引物和特异探针进行荧光定量PCR扩增反应；

c.根据扩增曲线判读Ct值，再根据熔解曲线判读Tm值。然后根据Ct值及Tm值判断待测样品中PIK3CA基因突变情况，若溶解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并且Ct<45，表明扩增区段发生突变。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述LNA锁核酸修饰的特异探针的核苷酸序列为CTC+TCT+GAA+ATC+ACT+GAGCAGGAG-PO₄或CCAC+CA+TGA+TG+TGCATCATTC-PO₄，其中“+”后的T，G，A或C为锁核酸修饰碱基。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述检测PIK3CA基因突变的引物SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.7。

9.根据权利要求6所述检测PIK3CA基因突变的方法，其特征在于：所述荧光定量PCR扩增反应的条件如下：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸25s，50个循环；95℃变性1min，40℃退火1min，65-95℃熔解，每秒钟升温0.02℃，每摄氏度收集25次荧光信号，最后40℃保存。