[发明专利]一种鸡胚病毒液病毒效价的测定方法有效
申请号: | 201510207883.8 | 申请日: | 2015-04-28 |
公开(公告)号: | CN104774973B | 公开(公告)日: | 2017-08-25 |
发明(设计)人: | 江兴华;陆奕滨 | 申请(专利权)人: | 福州大北农生物技术有限公司 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/02;C12R1/93 |
代理公司: | 福州君诚知识产权代理有限公司35211 | 代理人: | 戴雨君 |
地址: | 350000 福建省*** | 国省代码: | 福建;35 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 鸡胚病 毒液 病毒 测定 方法 | ||
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种鸡胚病毒液病毒效价的测定方法。
背景技术
现有的鸡胚病毒液病毒效价的测定方法存在以下缺陷:
1.鸡胚接种部位,选择在鸡胚及脐带侧与气室交界线上方约3mm处,由于每位画接种部位人员及接种人员不同,每位画蛋人员画蛋时画出的倍位离气室边距离有差虽,接种人员针头接进鸡胚的深浅有差别,易造成接种时病毒液未完全接入鸡胚的尿囊腔中,部分接至气室上,造成测定结果有较大的误差。
2.接种后的鸡胚用蜡封孔,蜡是用洒精灯加热的,温度较高,封在鸡胚上时由于温度高会造成鸡胚损伤或死亡,同时封蜡的速度较慢,效率低。
3.鸡胚收获及冷蛋,将后孵化到期的鸡胚从温室中拿出直接入置2-8度冷库冷蛋,将鸡胚从37度的环境中突然转至2-8度的环境中,对鸡胚的应激较大,易造成鸡胚不适应而用力挣扎,导致鸡胚的卵黄破裂,由于测凝集价是取鸡胚的尿囊液进行测定,在尿囊液中含有卵黄会影响血凝价的判定,影响病毒效价的测定结果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种提高测定结果准确性的鸡胚病毒液病毒效价的测定方法。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种鸡胚病毒液病毒效价的测定方法,包括以下步骤:
1)鸡胚接种部位的确定:选择鸡胚侧,鸡胚脐带周围,避开大血管的部位,画直径2-3mm的圆圈作为接种部位,此部位即为最佳的尿囊腔接种部位;
2)样品的稀释:取鸡胚病毒液,用生理盐水逐步稀释,得到不同稀释度的鸡胚病毒液稀释液;
具体可采用如下方法进行梯度稀释:用5ml玻璃吸管吸取灭菌生理盐水4.5ml加入试管中,共吸取若干支试管,根据样品不同而定所需试管数量,用1ml玻璃吸管吸取鸡胚病毒液0.5ml加入第一支试管,然后将试管放置在混匀器上混匀后,从第一支混匀后的试管中吸取0.5ml液体到第二支试管中,再混匀,依此类推,稀释到最后一支试管,得到不同稀释度的鸡胚病毒液稀释液;
3)接种:使用1ml的一次性注射器吸取所需稀释度的鸡胚病毒液稀释液,每个稀释度接种5枚10日龄鸡胚,每胚0.1ml;
4)封孔:用速凝胶水将上述接种后的鸡胚的接种部位封住;
5)鸡胚后孵化及鸡胚的收获冷蛋:将接种封孔后的鸡胚置36-37℃的恒温恒湿培养箱中培养,根据鸡胚病毒液不一样,后孵化及照蛋频率不一样,收获在规定时间内存活及死亡的鸡胚,然后将所有的活胚收取置20℃的温箱中1h,然后再移至15℃的温箱中1h,然后再将活胚移至2-8℃的冷库中冷却4-24h,等待测红细胞凝集价;
6)鸡胚红细胞凝集价的测定及EID50的计算:同一稀释度死亡的鸡胚等量收集胚液于同一试管中,活鸡胚单个收集胚液,分别测红细胞凝集价,胚液凝集价≥1:160者判为感染,计算病毒效价EID50。
在测定过程中如发现极个别鸡胚液浑浊有卵黄破裂的情况,将收集的尿囊液经高速离心机8000r/min离心10min后再用于血凝价测定。
上述测定方法中,根据鸡胚病毒液不一样,后孵化及照蛋频率有所差别,以测定新城疫鸡胚病毒液为例,所述的步骤3)接种的具体操作为:使用1ml的一次性注射器吸取10-7、10-8、10-9三个稀释度的新城疫鸡胚病毒液稀释液,每个稀释度接种5枚10日龄鸡胚,每胚0.1ml;
所述的步骤5)鸡胚后孵化及鸡胚的收获冷蛋的具体步骤为:将接种封孔后的鸡胚置36-37℃的恒温恒湿培养箱中培养,每24h照蛋1-2次,48h以前死亡的鸡胚弃去不计,在48-120h死亡的鸡胚随时取出,直立蛋盘,置2-8℃冷却120h,将所有的活胚收取置20℃的温箱中1h,然后再移至15℃的温箱中1h,然后再将活胚移至2-8℃的冷库中冷却4-24h,等待测红细胞凝集价。
本发明所述红细胞凝集价的测定方法按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》中红细胞凝集试验的测定方法。
本发明所述EID50的计算方法按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》中病毒半数致死(感染)量(LD50、EID50、TCID50)的测定方法。
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