[发明专利]一种用于病毒基因组核酸提取试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从临床标本中提取病毒基因组核酸试剂盒及其利用本发明试剂盒从临床标本中提取病毒基因组核酸的方法。本发明试剂盒可用于血浆、血清、淋巴液、脱落细胞、唾液、尿液、粪便和培养细胞上清液等，高效率提取获得病毒基因组核酸，可用于PCR扩增、筛查突变、基因分型、基因测序和样本储存等科研或临床诊断分析。

背景技术

完整的病毒颗粒包括外壳蛋白和内部的基因组DNA或RNA，每种病毒颗粒中只含有一种核酸，或为DNA或为RNA。病毒必须借助宿主细胞，利用宿主的复制系统，按照病毒基因的指令复制新的病毒而繁殖。

研究发现大多数逆转录病毒有一特殊的致癌基因，可使细胞发生恶性转化。如大约70％的宫颈癌病例与HPV-16和HPV-18这两种病毒有关；Epstein-Barr(EB)病毒与鼻咽癌、幽门螺杆菌与胃癌、乙型和丙肝肝炎病毒与肝癌、人类嗜T淋巴细胞病毒1型与白血病以及艾滋病病毒与卡波西肉瘤等均有着十分密切的关系。病毒基因组核酸编码了所有的病毒生命信息，从基因水平分析可以早发现、早诊断病毒的发生，为临床早治疗提供保证，防止癌症的发生。因而，获取病毒基因组核酸是科研和临床检测的关键，高效率提取病毒基因组核酸就尤为重要了。

目前临床常用的病毒基因组核酸提取方法有酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酞胺裂解法，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性；玻璃颗粒吸附法对DNA提取效果较好，但对RNA吸附能力一般，无法满足提RNA病毒的要求。

目前市场常用的病毒基因组核酸提取试剂盒产品分别是针对DNA和RNA提取的，很少将DNA和RNA同时提取进行下一步科研或临床检测需要。病毒基因组核酸采用磁珠或硅基磁珠法利用特异性吸附DNA和RNA能力，通过漂洗取出蛋白质和其他杂质，后用低盐溶液洗脱得到基因组DNA，操作中未用到酚、氯仿等有机溶剂以及强碱，但用磁珠或硅基磁珠对DNA和RNA吸附能力不足，获取的DNA和RNA浓度不高。

本发明利用能快速提取病毒基因组核酸的硅基磁珠法，不使用有机溶剂或强碱的同时，还能快速获取高浓度的DNA和RNA，以备下一步科研或临床检测足够使用。

发明内容

本发明提供一种从临床标本高效地提取病毒基因组核酸的试剂盒及其从提取病毒基因组核酸的方法，血浆、血清、淋巴液、脱落细胞、唾液、尿液、粪便和培养细胞上清液等，提取得到高浓度的病毒基因组核酸可用于科研或临床检测之用。

本发明是发明人多年来对上万例临床标本的提取病毒基因组核酸工作经验和技术改进，发现在含有硫氰酸胍在pH值为5.5时使得硅基修饰磁珠发挥更大吸附核酸能力，每1克硅基修饰磁珠吸附核酸达到10mg以上，包括DNA和RNA；另外还发现十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB)是一种阳离子去污剂，具在高离子强度的溶液中(＞0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸，可以去除标本中绝大数的蛋白、多糖、酚类等杂质；以及加入聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)K25能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少核酸中酚的污染，去除溶液中色素，同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

本发明在一个提取缓冲液1中一次性完成对标本的细胞裂解和DNA释放；蛋白、糖类和酚类等杂质的去除；硅基修饰磁珠吸附核酸等一系列过程。同时本发明采用磁力架配合硅基修饰磁珠使用，在临床检测中可以建立一个核酸提取平台，只需在磁力架上吸附磁珠并用乙醇洗涤以及无RNA酶水洗脱，即可获得高浓度病毒基因组核酸。因而，建立起的这一平台，将方便快捷的获取临床标本中核酸，以便进一步PCR扩增或基因检测。

本发明所提供的一种用于提取病毒基因组核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由蛋白酶K、硅基修饰磁珠、提取缓冲液、漂洗液I、漂洗液II及无RNA酶水组成，并配套含有磁力架；其中，优选，所述提取缓冲液由硫氰酸胍、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮K25、Tris-HCl、EDTA以及NaCl组成；优选，所述提取病毒基因组核酸，经超微量分光光度计检测，其A260/A280比值大于1.8；A260/A230的比值大于2.0；超微量分光光度计检测50μl脱落细胞液提取的核酸效率达到50μg/ml以上。

本发明所提供的一种病毒基因组核酸提取试剂盒，优选各组成分别为：

1)蛋白酶K：为10-100mg/ml蛋白酶K，1ml/支；