[发明专利]海蜇来源的生物活性肽及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及从海蜇(Rhopilema esculentum Kishinouye)的蛋白酶解产物中分离纯化具有1个新的生物活性肽，属于海洋生物技术领域。

背景技术

生物活性肽(biologically active peptide)是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物。生物活性肽的生物学意义主要体现在其吸收机制优于氨基酸和具有氨基酸不可比拟的生理功能两个方面，其生理功能主要有类吗啡样活性、激素和调节激素的作用，对生物体内的酶具有调节和抑制功能，免疫调节，抗血栓，抗高血压，降低胆固醇，抑制细菌、病毒，抗癌等作用，抗氧化和清除自由基作用，改善元素吸收和矿物质运输，促进生长，调节食品风味、口味和硬度等。因此，生物活性肽是药物筛选、制备疫苗和食品添加剂的天然资源宝库。

海蜇(Rhopilema esculentum Kishinouye)属于根口水母目(Rhizostomeae)，腔肠动物，作为一种药食同源的大型水母，在我国有广阔的资源分布和悠久的应用历史，早在一千六百多年前就已经开始为世人所食用。海蜇除食用外，全身均可入药，祖国医学认为其性味咸平，入肺、肝两经，有润肺、化痰、止咳、清热、消食、润肠等功效。据李时珍《本草纲目》所述，海蜇“气味咸温无毒、主治妇，入劳损、积血带下，小儿风疾丹毒，烫火伤”等，对气管炎、哮喘、高血压、胃溃疡、单纯性甲状腺肿大等症均有疗效。近年来我国医卫部门关于海蜇的药用价值也有许多报道。认为对治疗高血压、慢性气管炎、哮喘、热痰咳嗽、胃溃疡，单纯性甲状腺肿和颈淋巴结肿等，有一定疗效。尤其是海蜇的降压作用比较显著，药理研究证明：海蜇蛋白酶解产物对肾动脉狭窄高血压模型动物具有明显的降压作用。海蜇主要是由水，蛋白质、灰分、碳水化合物、脂肪等物质组成。近代研究分析表明：每100 g海蜇食部中，含水分65.0 g，灰分18.7 g，蛋白质12.3 g，碳水化合物3.9 g，脂肪0.1 g，钙182 mg，铁9.5 mg，硫胺素0.01 mg，核黄素0.04 mg，尼克酸0.2 mg，胆固醇16 mg。海蜇的许多药理活性都与其所含蛋白有关，由此推测海蜇的蛋白酶解产物中可能存在一定数量的生物活性肽。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种海蜇来源的生物活性肽的制备方法。

本发明从海蜇蛋白的酶解产物中分离纯化出1个新的生物活性肽，其序列分别为Val-Gly-Pro-Tyr，药理学活性研究显示其体外具有较高的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性，其IC₅₀为8.40±0.58 μM，但不限于此：

1.海蜇蛋白酶解产物的制备

将三矾海蜇洗净除去泥沙等杂质，切块，加入10倍量水，浸泡5―6小时，用清水洗涤后，重复上述操作三次，沥干后加适量水打浆，加水至10倍量，加入4% (以底物蛋白含量计，w/w%)海产品水解专用酶(南宁东恒华道生物科技有限公司)调整pH 至8.0，温度55℃水解4.5 h，100℃加热10 min灭酶后，4000转/分离心15 min，取上清液。

采用分子量为5000 Da的超滤膜对上清液进行超滤处理，收集分子量小于5000 Da的部分，再进行纳滤处理脱盐，纳滤条件：分子量为150―300截留膜，进膜压力11Bar，出膜压力11Bar。截留液进行冷冻干燥，冷冻干燥条件：温度控制条件：0―50 min，0℃升至20℃；50―300 min，20℃；300―350 min，20℃升至40℃；350―750 min，40℃；750―800 min，40℃降至20℃；真空度为40 pa，温度-30℃，最终得到海蜇蛋白酶解产物。

2.生物活性肽的分离纯化

2.1 Sephadex LH-20凝胶色谱柱层析

取1中海蜇蛋白酶解产物蒸馏水溶解成200 mg/ml溶液，Sephadex LH-20凝胶色谱柱(2.0 cm×60 cm)进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.6 ml/min，220 nm测定吸光度，收集各峰，冻干备用。

2.2 高效液相色谱的分离纯化

用高效液相色谱进一步分离纯化。色谱条件如下：色谱柱为反相C18键合硅胶柱(Waters Atlantis, T3, 250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：A水，B乙腈，梯度洗脱条件见下表1。流速：1.0 ml/min，柱温30℃，检测波长为220 nm和280 nm。收集主要色谱峰，冻干备用得到短肽样品。