[发明专利]能检测多种新生儿遗传病的RNA探针及基因筛查试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种新生儿遗传代谢病基因检测方法。

背景技术

在人类基因组计划完成十周年的今天，数百种遗传病可通过基因测序技术进行诊断，从而达到预防性干预和个体化治疗，减少病人及家属精神创伤和经济压力，延长病患生存时间的目的。基因诊断带给临床医学的发展革命性变化：癌症风险预测和癌症病人个性化用药指导；体外受精胚胎的基因筛查和无创产前筛查技术；新生儿及成人遗传病及其携带者筛查等。

根据2011年《中国妇幼卫生事业发展报告》统计，近年来，我国新生儿出生缺陷发生率呈上升趋势，由1996年的每万人中87.7人，上升到2010年的每万人中149.9人，增长幅度达到70.9％。2010年医院检测的前5位出生缺陷种类是先天性心脏病、多指(趾)、唇裂、先天性脑积水和神经管缺陷。这些缺陷共占全部出生缺陷的49.1％。出生缺陷不但是造成儿童残疾的重要原因，也日渐成为儿童死亡的主要原因，在全国婴儿死因中的构成比顺位由2000年的第4位上升至2011年的第2位，达到19.1％。

遗传性代谢病(inherited metabolic diseases,IMD)又称为先天性代谢缺陷病(inborn errors of metabolism，IEM)是因为维持机体正常代谢所必需的某种酶、运载蛋白、膜或受体等的编码基因发生突变，使其编码的产物功能发生改变，而出现相应的实验室检查异常和临床症状的一类疾病^[1]。它涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素循环、碳水化合物、溶酶体、类固醇等多种物质代谢的异常。该类疾病大多为单基因遗传病，虽然单一病种患病率低，但其种类繁多，所以总体发病率较高，总体发病率大约在1/800。我国每年约有2000万新生儿，其中约有2.5万遗传性代谢病患儿。

遗传性代谢病可以在新生儿期起病，也可以在成年期发病，常累及全身多个脏器，常慢性起病，反复急性发作，并随年龄、性别不同而有明显的差异。由于IMD早期症状无特异性，临床表现复杂多样，易与窒息、感染、中毒等获得性疾病混淆，造成漏诊或误诊。这类疾病发病后常呈进行性加重，如未能早期识别诊断、干预、治疗，常导致早期夭折或终身残疾，且以神经、智力残疾为最多，会严重影响人口素质，造成家庭和社会的沉重负担。目前，IMD的诊断方法主要有尿显色分析、枯草杆菌抑制试验、酶活性测定、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)、串联质谱联用技术(MS/MS)、单基因分析等。这些诊断方法用于IMD筛查具有局限性：(1)普遍通量低，一般一次只能检测一种，不能满足IMD可检出病种的逐年增多，并且需要对遗传性代谢病有准确的预判；(2)不同IMD的检测方法各异，样本多样，如一些疾病检测蛋白水平、而另一些疾病则检测基因水平，有些疾病需要尿液样本、而另一些则需要血液样本。因此不大适合以此开展大规模的遗传性代谢病的筛查，亟需要一种能高通量检测IMD多种疾病的技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供能同时检测多种新生儿遗传病的RNA探针、以及提供相应的能对多种新生儿遗传代谢疾病体外定性检测的方法，本发明的检测方法旨在降低检测成本。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种新生儿遗传代谢疾病基因体外定性检测的方法，包括以下步骤：

1 RNA探针制备

1.1 RNA探针设计：从NCBI的OMIM数据库(http://omim.org)获得22个新生儿遗传代谢疾病，43个基因的外显子区域，如表2所示：

表2

寡核苷酸设计原则为：

1)、每种基因不同转录本，通过位置信息均映射到HG19人类标准参考基因组上，选取能覆盖所有转录本的序列，设计步骤和原理见图1。

图1为某基因3个转录本的外显子集合方式，不同转录本映射到hg19参考基因组，生成包含所有转录本的序列的原理图；用于设计探针的序列区间，包含了所有转录本的外显子区域。

2)、设计探针时，避开RefSeq,Ensembl,CCDS,Gencode,VEGA,SNP,CytoBand数据库中的突变、SNP或插入缺失位点；

3)、外显子部分向3’和5’端的内含子中各沿伸10bp；

4)、每个探针至少有50％以上的重叠，探针CG含量在40％－60％之间的覆盖2倍；CG含量低于40％或高于60％的，覆盖3倍；如图2所示：