[发明专利]一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽及其制备方法和用途有效
申请号: | 201510118248.2 | 申请日: | 2015-03-18 |
公开(公告)号: | CN104725474B | 公开(公告)日: | 2020-09-08 |
发明(设计)人: | 吴倩倩;王斌;迟长凤;邓尚贵;孙坤来 | 申请(专利权)人: | 浙江海洋学院 |
主分类号: | C07K7/06 | 分类号: | C07K7/06;C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;A61K38/08;A61P3/02;A23L33/18 |
代理公司: | 北京国翰知识产权代理事务所(普通合伙) 11696 | 代理人: | 徐佳晶 |
地址: | 316022 浙江省*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 金枪鱼 肝脏 蛋白 源钙螯合肽 及其 制备 方法 用途 | ||
本发明涉及一种利用风味蛋白酶和中性蛋白酶酶解金枪鱼肝脏蛋白制备钙螯合肽的方法,具体是以金枪鱼肝脏为原料,通过双酶酶解,超滤、大孔树脂柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到钙螯合肽Trp‑Asp‑Lys‑Glu‑Asn‑Gly‑Pro‑Asp,ESI/MS检测分子量为959.93 Da。钙螯合肽对钙螯合能力强,可同时补充多肽/氨基酸和钙,是一种理想的补钙物质。
技术领域
本发明涉及一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽及其制备方法和用途,属于功能多肽制备技术领域。
背景技术
钙是人体必需的元素,对血液凝结、神经传递、激素释放、乳汁分泌和肌肉收缩等方面均有影响。同时,钙也是人类骨、齿的主要无机成分,约占人体质量的1.4%,所以每天必须补钙以维护人体中钙的代谢平衡。但是,我国多数人群摄入乳制品的数量少,钙补充不足,特别是在老人和儿童中缺钙现象更是明显。因此,提高钙的摄入量及其在体内的吸收利用度对于钙的补充非常重要。在钙螯合肽中,钙元素嵌合在氨基酸或多肽中间,避免了钙离子与食物中的酸性物质(植物酸、草酸等)形成沉淀,同时也可以避免肠道碱性环境对于钙的影响,显著提高钙离子的溶解度和稳定性,提高其吸收利用率。因此,钙螯合肽生物利用率高、吸收快,是一种理想的钙补充剂。
金枪鱼是世界远洋渔业的重要鱼类,据国际粮农组织(FAO)渔业统计年鉴的数据,近5 年大洋金枪鱼世界年产量均在650 万吨以上。金枪鱼加工过程中,产生约占总重量8%的肝脏,未被有效利用。经检索,以金枪鱼肝脏蛋白制备钙螯合肽未见报道。基于此,本发明根据钙螯合肽和金枪鱼肝脏的利用现状,提供一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽,并提供这种钙螯合肽的制备方法。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽的制备方法。
本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为:一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽,其特征在于该多肽的氨基酸序列为Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp(WDKENGPD),ESI/MS检测分子量为959.93 Da。
本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为:一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)金枪鱼肝脏蛋白酶解液的制备:金枪鱼肝脏从冰冻金枪鱼鱼体中取出后,用高速组织捣碎机匀浆,并向匀浆中加入2~3 倍体积的磷酸盐缓冲液(pH 7.0、0.02 mol/L),加热至50~60℃,恒温搅拌25~30 min,然后按照肝脏湿重的0.5~1.0%向溶液中加入风味蛋白酶,酶解4~6 h,然后将温度升至55~65℃,按照肝脏湿重的0.8~1.2%向溶液中加入中性蛋白酶,酶解3~6 h后,9 000 r/min离心25~30 min,取上清液,即为金枪鱼肝脏蛋白酶解液。
2)金枪鱼肝脏钙螯合肽的的制备:将制备的金枪鱼肝脏蛋白酶解液采用5 kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于5 kDa部分,得超滤酶解液,超滤酶解液按照体积比加入到装有15~20倍AB-8大孔树脂的层析柱中,用5~8倍柱体积水洗脱除去杂质,然后用5~8倍柱体积的95%乙醇进行洗脱,乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物,多肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化,得到金枪鱼肝脏钙螯合肽。
作为优选,所述步骤2)的凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为:
凝胶柱层析:将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为20~25 mg/mL的溶液,经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离,用双蒸水进行洗脱,根据225 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分,其中,具有最高Ca螯合活性的峰为凝胶层析酶解物;
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