[发明专利]一种酶纳米复合物及其可控自组装方法和在免疫分析中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，特别涉及一种酶纳米复合物及其可控自组装方法和复合物在免疫分析中的应用。

背景技术

酶联免疫分析(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)是临床、科研中应用广泛的特异性目标分子分析方法，其主要通过抗原-抗体分子间的特异性识别和酶分子的高效催化来实现对复杂混合物中目标分子的检测，传统的ELISA方法，通过在抗体分子上进行酶分子修饰来进行信号输出，通常是一对抗原抗体复合物对应一个酶分子，检测范围在0.1ng/ml-100ng/ml之间。随着技术的发展，该灵敏度已经不能够满足临床检测和科学研究中的需求，因此亟需发展新型的高灵敏分析方法。

目前，现有技术为了增加检测灵敏度，常见的方法是增加修饰的酶分子的数量从而提高检测灵敏度。主要包括以下几种方法：

1.层层自组装生物素化蛋白网络，例如现有技术“Layer by layer assembly of biotinylated protein networks for signal amplification”,Chem.Commun.,2013,49,2397，该技术通过多生物素标记的蛋白分子与亲和素反复的结合形成大的复合物，从而使生物素增多，结合大量亲和素修饰的酶分子，提高免疫分析灵敏度。但是，该方法存在步骤多，检测时间长，复合物表面酶分子数量不可控等问题，会造成信号不稳定或者批次间操作的差异等问题。

2.酶信号循环放大法，例如现有技术CN 102809648 A公开了一种酶信号循环放大高灵敏免疫检测方法，该方法主要是通过使用抗HRP的抗体与HRP交联，两者间相互结合形成大的酶分子复合物，来提高灵敏度。然而该方法交联会破坏HRP或抗体的活性，相互结合形成大团复合物后，尺寸、酶分子数量完全不可控，会造成信号输出不稳定等问题，而且制备过程复杂。

3.纳米自组装法，如现有技术“Seeding-induced self-assembling protein nanowires dramatically increase the sensitivity ofimmunoassays”，Nano Lett.9(6):2246-50.2009；“An auto-biotinylated bifunctional protein nanowire for ultra-sensitive molecular biosensing.Biosens Bioelectron”,26(4):1137-41.2010。纳米自组装方法是通过自组装的方法将酶分子和特异性结合分子整合在蛋白纳米线上，提高最终结合在抗原-抗体复合物上的酶分子数量，提高检测灵敏度。但是该方法也存在制备不可控的问题，酶分子数量不确定，最终导致信号不稳定，无法应用于定量检测。且制备过程繁琐、成本高。

4.纳米管、纳米颗粒法，在纳米材料(如金纳米颗粒、碳纳米管等)上修饰酶分子和抗体分子，通过提高酶分子数量来提高检测灵敏度的。但是该方法中修饰过程不可控，会导致蛋白分子功能失活，修饰数量和质量难以控制，批次间重现性差。

发明内容

本发明为了克服现有技术酶分子数量不可控、重现性差、信号不稳定等缺点，提供了一种酶纳米复合物及其可控自组装方法，复合物所含有的酶分子数量基本一致，并且通过调整组装比例，可以得到具有不同酶分子数量的酶纳米复合物。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种酶纳米复合物，包括位于核心层的纳米颗粒，位于中间层的生物素及位于外层的亲和素修饰的酶；其中所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M≥12，且M为整数。

优选的，酶纳米复合物(简称ENC)中所含有的酶分子数量可通过以下公式进行简略计算：

X＝n×M-i×n/2

其中，X代表ENC中酶分子的数量，M代表纳米颗粒的亚基数目，n代表ENC中所整合的生物素化的蛋白纳米颗粒(简称NP)的数量，i代表每个NP与相邻颗粒共享的亲和素修饰的酶分子的数量。

优选的，所述纳米颗粒为蛋白纳米颗粒；本领域技术人员知晓，所述纳米颗粒还可为病毒纳米颗粒。更为优选的，所述纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，其中，每个铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接24个生物素。本领域技术人员知晓，铁蛋白纳米颗粒还可为小铁蛋白，其中，每个小铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接12个生物素。