[发明专利]一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及人体疟原虫，具体来说是一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒及其方法。

背景技术

随着社会和经济的发展，以及全球疟疾消除工作的不断推进，许多国家的疟疾发病率持续下降，并逐步转变为以输入性疟疾病例为主。在中国，自21世纪以来，本地疟疾病例逐年减少，分布范围逐渐从24个省市减少为2014年的仅云南和西藏2省，但输入性疟疾病例却在逐年增加，同时报告输入病例的省市也逐渐扩展到全国各地。由于疟疾不再是我国居民的常见传染性疾病，因此，许多医务工作者对该病及其病原体的辨识水平逐步下降，从事该方面的专业人员亦逐年呈下降趋势，特别是在疟原虫种类的鉴定方面，仅仅依靠疟疾诊断的金标准—镜检，往往不能满足实践的需求。因此，国家疟疾诊断参比实验室依据形势的变化和《中国消除疟疾行动计划(2010-2020年)》关于疟疾病例的实验室确诊率100％的要求，不断寻求在现场更切实可行且能够准确鉴定疟原虫的检测方法。在疟原虫的3种检测方法中，以PCR为基础的基因检测方法，在准确确定疟原虫虫种和检测多种疟原虫混合感染病例方面能够弥补RDT和镜检方法的不足，已在低疟区、无专业疟疾镜检人员的机构及疟疾病例的复核确认工作中被广泛推荐和应用。当前最为常用的PCR检测体系为Snounou设计的以核糖体RNA小亚基(SSU rRNA或18S rRNA)基因为分子标记的巢式PCR检测体系(NP-1993体系)，及其随后修改完成的NP-2002体系。二者在第一轮反应和第二轮反应中分别有1条属特异引物和种特异引物的序列不同。但这2种体系在检测疟原虫方面均存在各自的缺陷。一方面，二者第二轮扩增体系扩增的间日疟原虫目标片段长度(120bp)和三日疟原虫的(141bp)仅有21bp的差异，在凝胶电泳图上不宜于区分，因此第二轮反应不易于采用多重PCR反应体系开展疟疾病原体检测，只能采用单一种特异引物对，分4次分别扩增检测；另一方面，NP-1993体系不能检测卵形疟中的wallikeri亚种，而NP-2002体系虽能检测，但除三日疟和间日疟外，第二轮PCR扩增获得的卵形疟原虫目标片段长度(226bp)与恶性疟原虫的(205bp)也仅有21bp的差异。因此，本实验室借鉴蔡贤铮等(2001)的双重PCR检测方法中的上游引物，重新设计了4种疟原虫的种特异下游引物，并对改进的新体系进行了特异性和敏感性的应用评价，以解决当前疟疾诊断实践中存在的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒及其方法，所述的这种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒及其方法解决了现有技术中检测疟原虫的方法过于繁琐，不宜采用多重PCR一次反应进行检测以及不能鉴别卵形疟wallikeri亚种的技术问题。

本发明一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其包含五条特异性的引物，其碱基序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示。

特异的引物序列为：

P1:5’-CGACGGTATCTGATCGTCTTC-3’；

P2：5’-TCATGATTGAGTTCATTGTGTTTG-3’；

P3：5’-TGCTTTGTATATTTATAACAAAGTTG-3’；

P4:5’-CAATACAACGTATCTGTTCTTTGC-3’；

P5:5’-TTTTAAGGACTTTCTTTGCTTCGG-3’。

进一步的，还含有聚合酶链式反应试剂、阳性对照和阴性对照，反应试剂含有10倍聚合酶链式反应缓沖液、灭菌的去离子水、四种脱氧核苷酸(每种脱氧核苷酸浓度为10mM)和Taq DNA聚合酶和属特异引物。

10倍聚合酶链式反应缓沖液包括如下成份：

Tris-HCl 100mM；

MgCl₂25mM。

属特异引物序列如下：

P6：5’-CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC-3(SEQ ID NO:6)；

P7：5’-TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG-3’(SEQ ID NO:7)。

本发明还提供了采用上述的试剂盒鉴别疟原虫种类的方法，包括如下步骤：

1)收集待检测的血液样品，提取总DNA，用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.1μg/ml-0.4μg/ml；