[发明专利]一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：包含五条特异性的引物，其碱基序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示。

2.根据权利要求1所述的一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：还含有聚合酶链式反应试剂、Taq DNA聚合酶、属特异引物、阳性对照和阴性对照。

3.根据权利要求2所述的一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：所述的属特异引物的序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。

4.根据权利要求2所述的一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：所述的聚合酶链式反应试剂中含有10倍聚合酶链式反应缓沖液、灭菌的去离子水、四种脱氧核苷酸，四种脱氧核苷酸的浓度均为 10mM。

5.根据权利要求3所述的一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：所述的10倍聚合酶链式反应缓沖液包括如下成份：

Tris-HCl  100 mM；

MgCl₂       25 mM。

6.采用权利要求1所述的试剂盒鉴别疟原虫种类的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)收集待检测的血液样品，提取总DNA，用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.1μg/ml-0.4μg/ml；

2)采用特异性的引物扩增DNA片段，所述的特异性的引物的碱基序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示；

3)将扩增的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，比较PCR扩增产物结果，如果DNA片段的大小为268 bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有恶性疟原虫，如果DNA片段的大小为446bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有三日疟原虫，如果DNA片段的大小为394bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有卵形疟原虫，如果DNA片段的大小为323bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有间日疟原虫，如果DNA片段不产生条带或者不能清晰的产生条带，说明该血液样品中不含有疟原虫。

7.根据权利要求6所述的鉴别疟原虫种类的方法，其特征在于：当提取的DNA浓度较低时，先用SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所述的引物进行首轮扩增后，再以其PCR扩增产物为模板DNA，应用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示特异引物进行扩增。

8.根据权利要求6所述的鉴别疟原虫种类的方法，其特征在于：取8μl PCR产物进行电泳，使用50bp DNA ladder 检测PCR片段大小。