[发明专利]一种微生物发酵制备无患子总皂苷的方法

说明书

技术领域

本发明属于林产化工领域，具体涉及无患子总皂苷的提取纯化方法，尤其涉及一种微生物发酵制备无患子总皂苷的方法。

背景技术

无患子，又称洗手果或圆肥皂，分布东南亚各国等广阔地域，资源丰富，在绿化、水土保持、环保等方面有广泛的应用。随着对无患子研究的深入，其化学成分及药理作用已逐渐被发现，引起人们越来越多的关注。无患子果皮的主要化学成分是无患子皂苷，是一个优良的天然表面活性剂，不仅因具有良好的乳化、分散、发泡、湿润等功效，作为天然活性物质用于日常生活或化妆品行业，更因其特殊的杀菌、镇痛、消炎、杀虫及降血压的药理作用被用于细菌感染、农药乳化剂以及高血压药物等领域。

无患子作为一种多功能植物，无论被用做药用植物、经济作物还是园林树种，均具有巨大的开发潜力。具有特殊生物活性的无患子总皂苷及其苷元的研究开发是关注的焦点。水提法和有机溶剂提取法是无患子皂苷的主要提取方法。直接水提法得率较高，但同时一些单糖、低聚糖、氨基酸、蛋白质、黏液质、果胶等溶解其中，导致提取物中皂苷纯度降低，且水提法也存在用水量大，浓缩成本高、废水排放多等缺点。此外，受植物细胞壁纤维组织的阻碍，水提法产品收率不高。超声波产生的振动可以造成植物细胞壁的瞬间破坏，可以促进植物细胞内物质的释放、扩散及溶解，从而提高提取率，降低水耗。酶具有高效性和特异性，可使植物细胞壁发生不同程度的改变，从而改变细胞壁的通透性，提高有效成分的提取率，但酶制剂的应用所引起的高成本也是亟待解决的问题。有机溶剂提取法虽提取率优于水提，但溶剂消耗量多，费用昂贵，在加上花时长且工艺繁琐，此外，残留的部分有机溶剂具有一定程度的毒性，将直接影响产品的质量，后处理对环境污染大。泡沫分离法提取过程中皂素有一定程度的分解，得率偏低；大孔树脂吸附分离法及超滤法对无患子总皂苷进行分离纯化，总皂纯度虽然提高，但工业化生产成本居高不下，无法推广应用。

微生物发酵是一种新型的无患子皂苷提取纯化的方法，其特点在于微生物培养条件粗犷、营养要求不严格、繁殖迅速。专利201210211918.1提供一种乳酸菌发酵制备无患子皂素的方法，并利用无患子果皮提取物中的纤维二糖、甘露糖和少量蛋白，经过酶解糖化发酵转化成乳酸，获得皂素和乳酸的复配产物，而高浓度的果胶等其他杂质无法有效的去除。专利201010550993.1提供一种无患子总皂苷的提取纯化的方法，利用酵母菌或米曲霉发酵对无患子皂苷进行分离纯化，但皂苷纯度并不高（只有45~60%）。同时，由于酵母菌有氧代谢只消耗葡萄糖，而水提液中的纤维素、果胶等成分无法降解；米曲霉代谢可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等，经继续反应又会产生糖类。该发明单独利用两种微生物菌株，并没有发挥两者的协调效应，技术比较单一，针对性不强。还有，提取后并没有进行纯化精制处理，产品的色泽深，呈黄棕色。

黑曲霉发酵可产生淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶等酶类，是降解糖类、蛋白质、果胶、纤维素等物质的优良生物资源；酵母菌发酵糖类的代谢产物以气体的形式放出，后续处理工艺简便；两种菌株先后接入提取液中，不仅专一性降解水提液中的营养成分，而且避免竞争性抑制作用，杂质去除率较高。黑曲霉和酵母菌生长速率快，呼吸作用消耗水提液中大量糖类和水份，一定程度上对皂苷起到了浓缩作用，在工业运用上不仅节约浓缩成本，而且节能环保。总的来说，系统地阐述微生物发酵提取无患子总皂苷的方法及其多种工艺的联合运用较少报道，纯度低、成本高或可操作性差等缺点仍是制约无患子皂苷规模化生产的关键因素。

发明内容

本发明的目的在于克服上述无患子总皂苷提取纯化方法中存在的缺陷，提供一种成本低廉、操作简便、健康无毒、纯度较高且稳定的无患子总皂苷提取纯化的新方法。

本发明所采用的技术方案为一种微生物发酵无患子制备总皂苷的方法，技术解决方案如下：

将干燥后的无患子果皮粉碎到1~20目，以料液比1:1~10加入去离子水，在25~80℃的恒温条件下浸提1~24h，重复提取1~5次，滤除不容物后合并提取液；

将驯化后黑曲霉和酵母菌分别接种于YPD培养基中，在20~37℃的条件下培养1~3天，获得对数期的种子液；

皂苷上清液中添加浓度为0.05~0.1%磷酸氢二钾和浓度为0.01~0.05%硫酸镁，接种含量为1％~10％经驯化后的黑曲霉种子液，在25~37℃的条件下培养2~20天；

再于上清液中接种含量为1％~10％经驯化后的酵母菌种子液，在20~30℃的条件下培养2~30天；