[发明专利]检测单个细胞中的核酸和鉴定异质大细胞群中罕见细胞的方法

说明书

本申请是申请日为2006年06月19日、申请号为200680021808.1、名称为“检测单个细胞中的核酸和鉴定异质大细胞群中罕见细胞的方法”的发明申请的分案。

相关申请的交叉引用

本申请是非临时性应用专利申请，要求Luo和Chen于2005年6月20日提交的先前临时专利申请题为“检测和计数异质大细胞群中罕见细胞的方法(Method of Detecting and Enumerating Rare Cells from Large Heterogeneous Cell Populations)”的编号USSN60/691,834的优先权，出于所有目的将此专利全部内容纳入本文作参考。

发明领域

本发明总体涉及核酸化学和生物化学试验。更具体说，本发明涉及原位检测单个细胞中核酸分析物的方法。本发明还涉及检测和鉴定单个细胞，特别是罕见细胞。

发明背景

大量证据证明癌细胞可脱离原发肿瘤部位经循环进入淋巴结、骨髓、外周血液或其它体液。已证明这种循环性肿瘤细胞(CTC)可反映原发肿瘤的生物学特性，包括肿瘤转移和复发能力。因此检测到CTC极可能表明疾病复发、肿瘤细胞播散和远处转移。所有这些都是鉴定高危癌症病人疾病状态的重要临床信息因素(如Vogel等,2002；Gilbey等,2004；Molnar等,2003；Vlems等,2003；Ma等,2003)。

临床上可用CTC检测结果作为预后指标的验证，但进展不如预计的那样快，主要是由于缺乏合适的检测技术。检测外周血或其它体液中CTC的一个关键性难题是循环中存在的CTC浓度极低，估计其范围是10⁶－10⁷个正常白细胞中只有一个肿瘤细胞。因此，此种应用性检测技术必须具有优越的灵敏度和特异性，假阴性和假阳性率应限制在可接受水平。

现有的一种方法采用免疫磁珠分离技术来检测CTC完整细胞(US6,365,362；US6,645,731)。采用此技术时，将癌症病人的血样与包被了抗上皮细胞表面抗原如EpCAM的抗体磁珠一起培育(Cristofanilli等，2004)，然后用电磁分离器分离磁珠标记的细胞。下游分析时进一步加工免疫磁珠富集的细胞组分来鉴定CTC。采用此技术，在一项前瞻性研究中显示，转移性乳腺癌病人治疗后的CTC数可独立预测疾病无发展的存活率和总体存活率(Cristofanilli等，2004)。虽然据报道此技术灵敏度高，但其应用受限于能否得到针对特定类型CTC的高灵敏度高特异性检测抗体。抗体非特异性结合其它细胞组分可能导致低信噪比而损伤CTC的检测。结合CTC的抗体也能低水平结合其它类型细胞上的抗原，导致高水平的假阳性。

检测CTC的另一种现有方法是检测血液中肿瘤细胞特异性表达的信使RNA。已采用实时逆转录聚合酶链反应(QPCR)将检测到的CTC结果与病人的预后相关联。已用实时RT-PCR检测结肠直肠癌病人外周血中的CEA mRNA(Ito等，2002)。术后血CEAm RNA阳性的病人无疾病存活率显著低于CEAm RNA阴性病例。这些结果提示在结肠直肠癌病人中如果肿瘤细胞进入血流将导致病人不良结局。另一报道显示临床上可利用多种mRNA标记对高危AJCC期IIBC和IIIAB黑素瘤病人的CTC作QPCR分子检测(Mocellin等，2004)。检测肿瘤特异性mRNA表达的优点是，可利用任何肿瘤特异性基因作为诊断/预后标志。然而QPCR方法需要进行分离和逆转录血样品中的mRNA，然后进行PCR反应，步骤费力。用此技术时由于样品污染染色体DNA，或所选标志在正常血细胞中也有低水平表达而常出现假阳性(Fava等，2001)。此外，此技术的检测灵敏度最高上限是每毫升血最多含约一个肿瘤细胞，因此此技术不能提供精确的CTC计数。

非常需要检测和定量血液和其它体液中单个细胞水平的肿瘤细胞特异性mRNA表达。能检测细胞悬液中单个细胞多种特异性mRNA表达的技术，应能灵敏和特异性检测和计数血液和其它体液中的CTC。此外，这种技术应能收集CTC细胞供下游细胞学和分子学分析。但目前已有技术不能满足这些需求。

原位杂交(ISH)技术是一种已建立的定位和形态学检测保存的组织切片或细胞制备物中特异性mRNA序列的方法(Hicks等，2004)。最常用的标本是冰冻切片、石蜡包埋切片或经细胞离心沉淀在载玻片上用甲醇固定的悬浮细胞。进行检测时采用与细胞和组织中特定核酸序列互补而能与其杂交的核酸探针。此技术的灵敏度即检测的域值水平范围是每个细胞10-20个拷贝的mRNA。