[发明专利]荧光定量RT-PCR鉴别检测蓝耳病毒株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物重大疫病防控检测技术，是属于一种病毒多个毒株的同时鉴别诊断的mRNA检测技术，具体地说是一种荧光定量RT-PCR技术同时鉴别检测蓝耳病各个毒株的方法，主要用于对蓝耳病病毒经典毒株(包括野毒和疫苗毒)、高致病毒株(包括野毒和疫苗毒)和天津疫苗毒株TJM-F92同时精确、快速地检测区分。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征，又称为蓝耳病，是一种由病毒引起的猪呼吸与繁殖障碍性疾病，是养猪业世界范围内的一种主要传染病，其高死亡率和高传染率给猪场带来了严重的经济损失。其主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)所致，现阶段流行的蓝耳病毒株包括蓝耳经典毒株、高致病毒株，而防治该病的有效方法是接种疫苗。依据PRRSV结构基因序列的不同可以将其分为欧洲型和美洲型两种基因型，而依据其致病力的不同，又可将其中的美洲型PRRSV分为经典株和高致病性株两种亚型。

对于蓝耳病的传统检测方法主要有动物试验、血清中和试验、免疫荧光试验、ELISA试验。其中，血清中和试验和ELISA试验检测时间长，且难以鉴别疫苗抗体和感染后产生的抗体。目前，PCR技术广泛应用到蓝耳病的检测中，但尚无同时检测蓝耳病经典毒株、高致病毒株以及疫苗毒株的荧光定量PCR方法。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。随着PCR技术研究和应用的深化，该技术在兽医领域得到广泛应用，几乎所有已知的DNA和RNA序列的病毒均可用PCR和RT-PCR方法进行特异性检测、诊断，如口蹄疫、猪瘟、蓝耳、伪狂犬病、细小病毒感染、传染性法氏囊病、禽流感等。

对于高致病性蓝耳病的检测方法，曾有人作出了改进，如授权公告号为CN101319253B的发明专利，公开了“一种高致病性蓝耳病的检测方法”，该方法主要通过环介导等温扩增快速检测技术，使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术(RT-LAMP)平台扩增靶序列的特定区域，在一系列质控和阴性、阳性对照的辅助下，从分子水平对包括高致病性蓝耳病毒核酸进行检测。该方法主要解决了ELISA法或RT-PCR法检测时间长、仪器条件要求高、检测灵敏度低的问题，所使用上游引物的核苷酸序列为5GCTCCGCGCAGGAAGGTCA,下游引物的核苷酸序列为GTGCGTCAGCGTTGTTGTC。但该方法仅能在特定条件下针对高致病性蓝耳病病毒进行检测，无法采用该方法同时检测另外两种毒株(经典毒株、疫苗毒株)。猪蓝耳病是重大疫病之一，属于强制性免疫，该技术无法鉴别诊断疫苗毒和引起疾病的野毒株，不能判定野毒感染。

而对于同时检测高致病性蓝耳病毒株和经典毒株的方法(试剂盒)，如申请公布号为CN103205507A的发明专利申请，公开了“一种检测高致病性猪蓝耳病与经典猪蓝耳病的RT-PCR引物及试剂盒”，其上游引物的核苷酸序列为GGCGACAATGTCCCTAAC，下游引物的核苷酸序列为GATGGCTTGAGCTGAGTAT。该方法的原理是利用高致病性猪蓝耳病和经典猪蓝耳病病毒的Nsp2基因的同源性，应用OLIG6.0软件，合成一对靶核苷酸序列的特异性引物，通过RT-PCR扩增后分别产生不同长度的目的片段，扩增HP-PRRS病毒特异性核酸目的片段长度为426bp，扩增经典猪蓝耳病病毒特异核酸目的片段为516bp，从而达到鉴别诊断两种病原的目的。但是，该试剂盒也仅能用于高致病性和经典毒株的同时检测，不能区分疫苗毒株，因此在蓝耳病疫苗强制性免疫的今天不能鉴别野毒感染，仍存在一定局限性，并不能完全替代现有的检测方法。为弥补现有检测方法的缺陷，发明人提出了如下技术方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种荧光定量RT-PCR鉴别检测蓝耳病毒株的方法，从根本上解决了现有检测方法无法同时检测高致病性蓝耳病毒株、经典毒株以及疫苗毒株的重大问题。

一方面，本发明请求保护一种荧光定量RT-PCR鉴别检测蓝耳病毒株的特异性引物，其技术要点是：所述特异性引物上游引物的核苷酸序列为：CTTCCGACACCATCCGAG，下游引物的核苷酸序列为：TTGGCAGGTTGGTCACAG。