[发明专利]一种西瓜基因表达的实时荧光定量PCR分析方法

说明书

技术领域

本发明属于基因表达分析技术领域，具体涉及西瓜基因表达的实时荧光定量PCR分析方法。

背景技术

实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，简称qRT-PCR)是基因表达定量分析中的常用技术，是分子生物学研究中不可缺少的重要研究手段，它是基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)和反转录技术发展起来。

在基因表达分析过程中，首先要提取样本的RNA，然后反转录成cDNA，之后再以cDNA为模板，利用目标基因的特异引物，采用qRT-PCR技术对基因表达进行定量分析。由于提取RNA过程中通常会有基因组DNA污染，所以反转录成cDNA之前，需要利用相关的酶来降解RNA样品中的基因组DNA(简称为gDNA)。但对于缺乏经验的实验人员而言，通常会遗漏去除gDNA的步骤，导致进行基因表达的定量分析时，除了扩增出cDNA上的基因片段外，还可能扩增了gDNA上的目标片段，从而大大增加了基因的表达量，导致结果错误。此外，即使利用酶切的方法降解gDNA，也不能完全消除酶切后的小片段gDNA对表达结果的影响。因为，有些gDNA上的假基因可能只是被酶切成了小片段，并没有被完全降解，这些假基因与对应的能表达的基因在序列上是一样的，因此，同样可能扩增出这些假基因的片段，导致目标基因的表达水平被高估。

目前在基因引物设计过程中，研究人员通常是在获取目标基因的序列后，利用Primer3等引物设计软件设计基因的特异引物，再将之用于基因的表达分析。这种引物设计方法并不考虑引物在基因上的结合位点，我们将这种方法称为随机结合位点的引物设计。利用这种方法设计出来的引物虽然能保证扩增出目标基因，但也可能在cDNA和gDNA上都能扩增出相同大小的片段。因此，无法在基因表达分析过程中排除gDNA污染和假基因的影响，从而使基因表达水平被高估，导致结果错误。所以，基因表达分析中需要一种新的引物设计方法，来排除可能的gDNA污染和假基因的存在对基因表达分析的影响，保证结果的准确性。

发明内容

在利用qRT-PCR进行基因表达分析过程中，为排除cDNA样品中gDNA污染和假基因片段对表达结果造成的影响，克服一般基因引物设计方法的缺陷，确保基因表达分析结果的准确性，本发明提供了专门用于西瓜基因表达分析中一种跨相邻外显子接头位点引物的设计方法，利用该方法设计的基因特异引物可以使实验结果不受cDNA样品中存在gDNA污染以及假基因片段的影响。

本发明解决其技术问题所采用的原理是：位于gDNA上的基因表达时，先转录成前体mRNA，前体mRNA经过编辑形成成熟的mRNA，然后成熟mRNA再翻译成蛋白，执行相应的生物功能。在前体mRNA的编辑过程中一个重要内容就是切除前体mRNA上的内含子。因此，基因的成熟mRNA序列与其DNA序列相比就只有外显子而没有内含子。如将基因的特异引物设计在两个相邻的外显子的接头位点，那么以cDNA为模板时能扩增出目标基因的片段，而在gDNA上，由于相邻两个外显子接头位点被内含子分隔，导致以gDNA为模板进行PCR扩增时引物无结合位点，就无扩增产物。因此，基因表达分析时，即使cDNA样品中有gDNA的污染或则假基因的片段，由于无法扩增而克服了其对基因表达结果的影响。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

从葫芦科基因组数据库(http://www.icugi.org)获取目标西瓜基因的完整序列和结构信息；根据目标基因结构信息，确定外显子的接头位点；采用Primer3Plus(http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)进行引物设计，将两个相邻外显子序列接头位点上下游15bp的序列用“{}”标识，限制基因的一个引物在这个两个相邻外显子结合位点区域进行设计，然后将扩增产物大小设为80-150bp，以满足qRT-PCR的要求；分别以cDNA和gDNA为模板进行PCR扩增，然后电泳检测，如在cDNA模板上扩增出了目标片段，而在gDNA模板上无扩增产物，则引物设计正确，用该引物对目标基因的表达进行qRT-PCR分析；如扩增失败，则选择另外的外显子结合位点按照上述方法重新进行引物设计。