[发明专利]一种折叠引物及其PCR扩增方法

权利要求书

1.一种折叠引物，其特征在于：该折叠引物在PCR反应中具有三重退火温度和自我封闭的功能；所述的折叠引物包括3′端常规引物部分和5′端特殊设计引物部分；其3′端常规引物部分为根据需要检出和/或鉴定的特异位点设计与靶基因互补的一段核苷酸序列，其组成和长度决定引物与靶序列退火温度的上限，称为引物的初始退火温度；其5′端特殊设计引物部分主要由常规引物部分的5′端添加与其3′端互补的碱基组成；该互补碱基的组成和长度决定引物折叠自身退火的温度，该引物自身退火达100％的温度称为折叠温度，决定初始退火温度的下限；所述的折叠引物PCR反应经过至少2个循环后，扩增子的5′端已生成折叠引物全长的互补序列；此后的引物延伸扩增主要以扩增子为模板，此时折叠引物全长与扩增子互补退火，而不只是常规引物部分，折叠引物的退火温度将自动升高≥5℃，称为二级退火温度；

折叠引物的PCR扩增方法，包括以下步骤：

(1)采用镁、酶分离组合试剂模式，分别配制至少含有1对折叠引物的无镁加酶组合试剂和制备含镁模板DNA；在一个PCR管内加入10ul无镁加酶组合试剂和5ul含镁模板形成完整反应体系，即可上机反应；

(2)折叠引物PCR反应:预热后先进行至少1组初始退火温度循环，在循环内或/和循环组间至少用2个初始退火温度分级退火，每组至少扩增2个循环；随后进入高温退火循环组：在循环内用1-3个高温退火温度分级退火扩增36-56个或更多循环；在60-70分钟内连续扩增60个或更多循环，可完成从简单到复杂的多重反应；

(3)扩增产物分析鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳分离鉴定；或采用高效质谱测定扩增片段的分子量对比数据库储存的同类或类似种群数据进行鉴定；也可采用微阵列或低密度芯片技术鉴定扩增片段；

所述引物序列为：5’ CCGTGATGTGGAGAATGTTTTGCATCACIT 3’。

2.如权利要求1所述折叠引物，其特征在于，所述折叠引物的3′端常规引物部分，其3′末端第2-4位特设1-2个脱氧肌苷和/或取代错配碱基。

3.如权利要求1所述的折叠引物，其特征在于，所述的折叠引物5′端特殊设计引物部分，特殊设计引物部分与3′端互补序列是从第2-4碱基起至第8-20碱基添加7-19个与3′端互补碱基，而5′末端第1位则特设为与3′末端第1位错配碱基。

4.如权利要求3所述的折叠引物，其特征在于，所述的错配碱基为C或G中的一种。

5.如权利要求1所述的折叠引物，其特征在于，所述的镁酶分离组合试剂为不含有氯化镁和模板DNA的PCR反应全套试剂。

6.如权利要求1所述的折叠引物，其特征在于，所述的预热，其温度为82-95℃，预解链时间为1.5-3min；所述的循环为解链、退火、延伸三步骤的循环，并且在循环过程中在前4～20个循环内的解链温度为86-95℃、解链时间为5-10s，待4～20个循环以后、采用解链温度为80-86℃、解链时间为5-10s；退火分为初始退火、高温退火；所述的初始退火温度可在循环内或循环间按照递增或者递减的顺序进行分级退火处理，或者在循环内或循环间按照交替递增或递减的顺序进行分级退火处理，每个退火温度处理的时间为5-10s；所述的初始退火温度在45-70℃；在多重PCR扩增过程中，各对引物之间的初始温度相差至少3-5℃；所述的折叠引物，其折叠温度为43-68℃，并在循环过程中，各对引物的折叠温度比其初始退火温度低1-2℃；所述的折叠引物，在PCR扩增过程中，其高温退火时的温度为65-72℃，退火的时间为5-20s；所述的延伸温度为72-75℃，延伸时间为10-20s。

7.如权利要求1所述的折叠引物，其特征在于，所述的高温退火可以采用单一高温进行退火处理，也可以采用2-3个高温退火温度进行递增分级退火处理，其高温退火温度范围在65-72℃之间，退火时间为5-20s。