[发明专利]参与精子转染外源DNA的基因筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种参与精子转染外源DNA的基因筛选方法。

背景技术

CD4分子是一类相对分子质量约为55 000(单位)的单链跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，主要表达于部分T细胞、胸腺细胞、某些B细胞和EB病毒转化的B细胞、单核-巨噬细胞以及特定区域的脑细胞表面。其在T细胞发育、信号转导、细胞间通讯、细胞免疫应答和体液免疫应答的过程中发挥重要作用。然而，当CD4分子的正常免疫学功能失调或遭到破坏时，即可能导致疾病的发生。近几年的研究表明，HIV-1的包膜糖蛋白gp120与T细胞表面的CD4受体结合，介导病毒进人细胞而造成细胞病变。同时，CD4分子作为精子膜蛋白受体，有很多学者都进行了相关研究，发现CD4在精子内化外源DNA上发挥着重要作用。Lavitrano发现敲除CD4基因的小鼠的精子具有与野生型小鼠相同的结合外源DNA能力，不同的是CD4基因敲除小鼠精子内化外源DNA的能力也随之消失，而野生型CD4小鼠仍然有30％～54％的阳性率；野生型CD4小鼠的成熟精子与CD4抗体孵育后，其结合性能与CD4敲除小鼠完全一致，研究表明CD4可能参与了外源DNA的内化转运机制。其他人的研究也显示精子膜上CD4参与外源DNA转运；而且还发现封闭CD4分子的精子仍部分具有转运外源DNA的能力。这说明精子结合转运外源DNA不仅有CD4发挥作用，而是多个分子共同作用的结果。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选参与精子转染外源DNA基因的方法。按以下步骤进行：

一、构建重组质粒pGB-mCD4；

二、cDNA文库筛选获得待测基因；

三、待测基因阳性克隆抽提酵母质粒并扩增；

四、质粒pGB-mCD4与待测基因阳性克隆酵母质粒共转入酵母双杂交菌株Y190；

五、进行β-galactosidase显色反应，显色结果变蓝的为阳性，分析，获得参与精子转染外源DNA的基因。

酵母双杂交菌株Y190的报告基因为双基因HIS3和lacZ，可以减少双杂交的结果假阳性。本发明将诱饵载体pGB-mCD4转入酵母双杂交菌株Y190中，由于在酵母双杂交菌株Y190中CD4没有与相互作用蛋白作用，诱饵载体的BD端不能和相互作用蛋白的AD相互靠近进行作用，因此不能启动下游报告基因HIS3和lacZ的表达，表现为β-galactosidase显色不变蓝。因此，本发明构建的诱饵载体pGB-mCD4在酵母双杂交菌株Y190中不能自激活(β-galactosidase显色实验结果为不变蓝，如图2所示)。

利用诱饵载体pGB-mCD4和待测基因质粒共转酵母双杂交菌株Y190，即进行酵母双杂交，之后再进行β-galactosidase显色反应、分析，获得可与CD4相互作用的基因，得到与CD4共同作用转运外源DNA的基因。

通过本发明的方法能够大量、快速的获得与CD4共同作用转运外源DNA的基因，为精子介导基因转移机理的研究开辟新的思路，最终为建立简单、稳定、高效的精子介导转基因方法学奠定基础。

附图说明

图1是重组质粒pGB-mCD4的凝胶电泳图。

图2是重组质粒pGB-mCD4的β-galactosidase显色实验结果图。

图3是质粒pGB-mCD4与待测基因阳性克隆酵母质粒共转入酵母双杂交菌株Y190后β-galactosidase显色实验阳性结果图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式参与精子转染外源DNA的基因筛选方法，按以下步骤进行基因筛选：

一、构建重组质粒pGB-mCD4；

二、cDNA文库筛选获得待测基因；

三、待测基因阳性克隆抽提酵母质粒并扩增；

四、质粒pGB-mCD4与待测基因阳性克隆酵母质粒共转入酵母双杂交菌株Y190；

五、进行β-galactosidase显色反应，显色结果变蓝的为阳性，分析，获得参与精子转染外源DNA的基因。

重组质粒pGB-mCD4的β-galactosidase显色实验结果未变蓝，为阴性，如图2所示。利用诱饵载体pGB-mCD4和待测基因质粒共转酵母双杂交菌株Y190再进行β-galactosidase显色反应，β-galactosidase显色结果变蓝的为阳性(如图3所示)，说明BD与AD接近激活下游启动子的报告基因表达，证明该基因与CD4共同作用转运外源DNA，参与了精子转染外源DNA。