[发明专利]一种用于结核分枝杆菌及其抗原双重染色的试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于结核分枝杆菌及其抗原双重染色的试剂盒及其方法。

背景技术

结核病是严重威胁人类健康的传染性疾病，全球有1/3的人口感染了结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)，每年有200万人死于结核病，其死亡率在传染性疾病中仅低于艾滋病排第二。目前结核病诊断的金标准是痰细菌学检测。但是痰涂片阳性率低，痰培养需要一个月的时间才能出结果，因此最常用的痰细菌学检测手段无法满足临床确诊的需求。此外，近年来基于免疫学的ELISPOT以及基于核酸检测的PCR等新技术也应用到了结核病诊断中。但是ELISPOT技术无法分辨潜伏感染者与真正的结核病患者，因此在MTB感染率非常高的中国诊断价值非常有限。而多种PCR技术由于对设备、技术人员的要求高，且测试成本高等原因无法普及到各级医疗机构。病理学诊断是结核病确诊的重要途径，尤其是对于痰细菌学阴性的结核病患者及肺外结核患者的诊断。结核病组织病理学特征是肉芽肿性炎症，病变内可见类上皮细胞、朗汉斯巨细胞以及干酪样坏死等。由于其他感染性或非感染性疾病也可能会出现类似病理变化，临床上确诊结核病还需要在组织标本中检测到MTB的存在。目前使用最广泛的MTB检测方法是萋尼氏(Ziehl-Neelsen)染色法，但存在敏感性低，寻找MTB费时费力等缺点。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于结核分枝杆菌检测的组织切片染色方法。

本发明提供的用于结核分枝杆菌检测的组织切片染色方法，包括如下步骤：

1)将待检测组织切片与抗MTB抗原抗体溶液反应，得到一抗结合切片；

2)将所述一抗结合切片与二抗溶液反应，得到二抗结合切片；

3)用DAB染色液对所述二抗结合切片进行染色，得到DAB染色切片；

4)用石碳酸复红染色液对所述DAB染色切片染色，得到石碳酸复红染色切片；

5)用苏木素染色液对所述石碳酸复红染色切片染色，得到染色切片，实现组织切片染色。

上述方法中，所述抗MTB抗原抗体为抗MTB抗原多克隆抗体；

所述MTB抗原的氨基酸序列为序列表中序列1；

所述二抗溶液的二抗为羊抗兔IgG抗体；所述羊抗兔IgG抗体具体HRP标记的羊抗兔IgG抗体。二抗溶液采用羊抗兔-HRP二抗，迈新生物的产品。

上述方法中，步骤1)中，所述反应的温度为23-28℃，所述反应的时间为0.5-2h；

步骤2)中，所述反应的温度为23-28℃，所述反应的时间为10-20min。

步骤3)中，所述染色时间为1-10min、染色温度为23-28℃；

步骤4)中，所述染色时间为20-90min、染色温度为23-28℃；

步骤5)中，所述染色时间为0.5-2min、染色温度为23-28℃。

上述方法中，在步骤1)-2)之间，还包括如下步骤：洗涤所述一抗结合切片；

在步骤2)-3)之间，还包括如下步骤：洗涤所述二抗结合切片；

在步骤3)-4)之间，还包括如下步骤：洗涤所述DAB染色切片；

在步骤4)-5)之间，还包括如下步骤：先用分化液脱色所述石碳酸复红染色切片得到脱色后石碳酸复红染色切片，再洗涤所述脱色后石碳酸复红染色切片；所述洗涤采用的洗涤液具体浓度为0.01M、pH值为7.4的PBS或水；

在步骤5)中，在所述染色得到染色切片后还包括如下步骤：先分化液脱色所述染色切片，得到脱色后染色切片，再洗涤所述脱色后染色切片；所述洗涤采用的洗涤液具体浓度为0.01M、pH值为7.4的PBS或水。

上述方法中，所述脱色时间均为30秒-60秒。

上述方法中，所述待检测组织切片为石蜡包埋的待检测组织切片。

上述方法中，在所述方法的步骤1)前，还包括如下步骤：

A、将所述石蜡包埋的待检测组织切片进行脱蜡水化，得到脱蜡水化后切片；

B、将所述脱蜡水化后切片在浓度为0.01M、pH值为6.0的柠檬酸缓冲液中高压修复，得到修复后切片；

所述高压的压力为80-100千帕；

所述修复时间为90s，所述修复的温度为100℃；

本发明的另一个目的是提供一种用于结核分枝杆菌检测的组织切片染色的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括DAB染色液、石碳酸复红染色液和苏木素染色液。