[发明专利]一种改良的扩增受阻突变检测体系引物及应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种改良的扩增受阻突变检测体系引物及应用。

背景技术

肺癌是当今最常见的恶性肿瘤之一，也是高致死率的癌症之一，其中80-85％的患者为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancers，NSCLC)。近年来随着分子生物学水平的提高，产生了针对分子靶点的抗肿瘤药物。这些药物针对性强，能特异的杀伤肿瘤细胞，效果显著。其中以表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)为靶点的酪氨酸激酶抑制剂在非小细胞肺癌治疗中日渐突出。EGFR作为癌症治疗的靶点，靶向药物主要有两类：一类是作用于受体胞内的小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)主要包括吉非替尼、埃罗替尼、EKB-569、PKI-166、GW-2016及CI-1033；另一类是作用于受体胞外区的单克隆抗体(MAb)，包括西妥昔单抗(cetuximab)、ABX-EGF及EMD72000。这些药物通过阻断EGFR的活性抑制其磷酸化和信号传导，从而起到抗肿瘤作用，同时也能增加化疗和放疗的抗肿瘤疗效。

大量研究表明，并非所有肺癌患者从TKI治疗获益，EGFR突变与TKI疗效相关。携带EGFR基因突变的NSCLC患者在接受易瑞沙和特罗凯治疗时疗效显著，但是研究发现EGFR外显子20上的T790M位点和插入为耐药位点，会抑制易瑞沙和特罗凯等药物疗效。临床检测这些突变能够很好地预测TKI治疗效果，为肿瘤用药提供指导依据。

扩增受阻突变检测体系(Amplification refractory mutation system，ARMS)，又称等位基因特异PCR(Allele-specific PCR，AS-PCR)，是目前应用最广的突变检测技术，其原理利用Taq酶缺失校正活性完成突变的检测。在ARMS的反应体系中，引物上标记2个不同荧光素、或加入荧光探针等 方法都是以实时荧光PCR为基础的基因分型方法。可检测出样品中含量低至0.1-1.0％的突变基因。目前，该方法已成为国际上肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，其在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。ARMS引物设计时，通常在3’-末端起第2个碱基位置加入错配，以抑制野生型模板的扩增，因此ARMS具有很好的SNP检测能力；然而，ARMS技术的缺点在于敏感性较低，只能检测10个拷贝左右的突变。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种有效提高ARMS引物的敏感性和特异性的改良的扩增受阻突变检测体系引物。

本发明的改良的扩增受阻突变检测体系引物，包括上游引物和下游引物，其中，上游引物的5’末端引入2-3个不与靶序列配对的碱基，并且所述上游引物3’末端倒数第三个碱基位置引入错配碱基。

进一步的，所述上游引物5’末端引入的碱基为GG、CC或CG。

进一步的，所述上游引物3’末端的错配碱基为强错配碱基和中强错配碱基，所述强错配碱基包括C-T和G-A，所述中强错配碱基包括A-A、G-G和C-C。

本发明的另一目的是提供一种改良的扩增受阻突变检测体系引物在扩增受阻突变检测体系中的应用。

本发明的另一目的是提供一种引物，用于采用扩增受阻突变检测体系检测EGFR21外显子L858R G>T突变，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的5’末端引入2-3个不与靶序列配对的碱基，并且所述上游引物3’末端倒数第三个碱基位置引入错配碱基。

进一步的，所述上游引物5’末端引入的碱基为GG、CC或CG。

进一步的，所述上游引物3’末端的错配碱基为强错配碱基和中强错配碱基，所述强错配碱基包括C-T和G-A，所述中强错配碱基包括A-A、G-G和C-C。

进一步的，所述上游引物为具有SEQ ID NO：1所示序列的上游引物，所述下游引物为具有SEQ ID NO：4所示序列的下游引物。

本发明的另一目的是提供一种检测EGFR21外显子L858R G>T突变的试剂盒，其特征在于：包括具有SEQ ID NO：1的上游引物以及具有SEQ ID NO：4所示序列的下游引物。

进一步的，还包括具有SEQ ID NO：5的Taqman探针，所述Taqman探针的5’末端和3’末端分别被FAM和BHQ1标记。