[发明专利]快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR‑RFLP方法有效
| 申请号： | 201510016355.4 | 申请日： | 2015-01-13 |
| 公开（公告）号： | CN104611424B | 公开（公告）日： | 2017-03-29 |
| 发明（设计）人： | 彭昕;吉庆勇;张煜炯;范三微;何军邀 | 申请（专利权）人： | 浙江医药高等专科学校 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 杭州斯可睿专利事务所有限公司33241 | 代理人： | 周豪靖 |
| 地址： | 315100 浙江省宁波市鄞州*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 快速 鉴别 三叶青 及其 多种 伪混品 pcr rflp 方法 | ||
1.一种快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法，包括提取药材DNA和琼脂糖凝胶电泳分析，其特征在于，用一对扩增核糖体 DNA 的内转录间隔区（ITS2）序列的正反向引物进行PCR扩增及用限制性内切酶消化PCR产物，根据酶消化产物琼脂糖凝胶电泳分析结果判断药材三叶青的真伪及是否掺入了伪混品。
2.如权利要求1所述的一种快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述PCR扩增基因为核糖体 DNA 的内转录间隔区（ITS2），具有SEQID NO.1所述的基因序列。
3.如权利要求1所述的一种快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法，其特征在于，PCR扩增引物具有SEQID NO.2和SEQID NO.3所述的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的一种快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法，其特征在于，使用的限制性内切酶为NCOⅠ，其识别序列为CCATGG。
5.如权利要求1所述的一种快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法，其特征在于，PCR扩增的基因片断大小为400~600bp。
6.如权利要求1所述的一种快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法，其特征在于，优选的PCR扩增的基因片断大小为480~550bp。
7.如权利要求1所述的一种快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法，其特征在于，酶消化后药材三叶青样品电泳分析出现335bp和200bp条带，而其伪混品的DNA扩增产物不被限制性内切酶消化。
8.如权利要求1所述的一种快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述的PCR反应条件为：95℃预变性5min；然后进入循环，95℃变性30秒，45~55℃退火30秒，72℃延伸40秒，25~35 个循环；最后72℃延伸10 分钟。
9.如权利要求1所述的一种快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法，其特征在于，PCR扩增产物的限制性内切酶酶切反应条件为：10μL PCR产物，2μL 10×酶切缓冲液，8μL灭菌超纯水，5~25U限制性内切酶，20~37℃恒温2~8小时。
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