[发明专利]一种用于蓝舌病病毒16型荧光RT-PCR检测的特异性引物对及探针

说明书

技术领域

本发明涉及蓝舌病病毒16型（BTV-16）荧光RT-PCR检测用引物和探针序列。

背景技术

蓝舌病（Bluetongue, BT）是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒（Bluetongue Virus, BTV）引起，由吸血昆虫通过叮咬传播，感染反刍动物致其发病的非接触性传播的虫媒病毒病，本病以口腔、鼻腔和胃肠道黏膜发生溃疡性炎症变化为主要特征。蓝舌病病毒主要引起绵羊发病和死亡；牛和山羊动物常为隐性感染，偶有发病和死亡。世界动物卫生组织（OIE）2009年修订的《陆生动物卫生法典》将蓝舌病列为法定报告的多种动物共患疫病，我国2008年新修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将其列为一类动物疫病。

蓝舌病病毒粒子呈二十面立体对称，直径为70～80nm，具有双层衣壳。病毒基因组大小约为19，200个碱基对，由10个节段的双链RNA组成，其中由第二片段编码的结构蛋白VP2为主要的血清型型特异性蛋白。 目前世上已知的BTV可分为26个血清型，不同血清型之间无交叉保护。我国于1979年在云南首次发现绵羊蓝舌病，随后相继在湖北、安徽、四川、重庆、山西等地出现蓝舌病疫情。病毒分离和血清学调查结果表明，我国至少存在11个血清型的蓝舌病病毒，即BTV-1、2、3、4、9、11、12、15、16、21和23型。从湖北和四川发病绵羊体内分离到了BTV-16型病毒。

针对蓝舌病的防控主要采用疫苗免疫和媒介昆虫控制相结合的办法。只有采用与疫源地流行的相同血清型BTV种毒制备的疫苗进行免疫，才能获得良好的免疫效果，因而，快速鉴定出BTV致病毒株的血清型已成防控蓝舌病的关键。常规的临床样品中BTV血清型的鉴定需先分离病毒，再经中和试验进行判定，操作较为繁琐，耗时长达1个月以上。

实时荧光PCR技术以其特异性好、灵敏度高、简便快速等优点在许多领域得到了广泛应用。欧洲国家应用该技术解决了对BTV-8型病毒的快速检测和鉴定的难题。筛选出针对不同BTV血清型的引物、探针，建立相应的荧光RT-PCR检测方法，对临床样品中的BTV血清型作出快速准确的诊断，将有助于制定相关防控策略。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蓝舌病病毒16型（BTV-16)荧光RT-PCR检测用引物和探针。

本发明采用以下技术方案：通过对我国BTV毒株进行全基因组序列测定，并将其与GenBank中公布的国内外BTV的VP2基因序列进行比对分析，选取在BTV-16型毒株间保守而与其它25个血清型BTV核酸差异较明显的区段进行引物和探针的设计与合成，合成多组引物和探针，通过用于对不同血清型BTV毒株的荧光RT-PCR检测，再从中筛选出只能扩增BTV-16样品的最优组合。

用于检测蓝舌病病毒16型核酸的荧光RT-PCR引物序列和探针序列组如下：

上游引物BTV16-L2-1585F：5’- GCTCCAATGTTTAATGCAAAAGTG -3’；

下游引物BTV16-L2-1705R：5’- TTAACAGATCGATACAATCCGCAC -3’；

特异性探针序列如下：

BTV16-L2-1622PB： 5’-FAM- TCGAGTTAGCGCAACGAAAGAATGAAGAC–BHQ1-3’，其中，FAM为荧光报告基因， BHQ1为荧光淬灭基团。

将按上述引物、探针与通用的商品化荧光RT-PCR扩增试剂盒组合后，建立检测蓝舌病病毒16型的实时荧光RT-PCR检测方法。

蓝舌病病毒16型实时荧光RT-PCR检测方法采用以下步骤：

（1）制备待测模板：可采用商品化RNA提取试剂盒或Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取各种来源样品中BTV基因组RNA， 将所提取的核酸样品需在配制反应液前经热变性使其变为单链RNA后备用；

（2）配制引物、探针液：选取上述的引物和探针，溶解配制多个工作浓度；

（3）建立反应体系：参照通用的商品化荧光RT-PCR扩增试剂盒的说明书配制，利用系列梯度方阵测定筛选法确定最佳的引物浓度和探针浓度；

（4）确定反应程序：筛选出最佳的扩增程序；

（5）选择仪器的检测通道；

（6）样品上机检测。

本发明的主要特点是：充分运用PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，具有结果可靠和准确灵敏、操作简单、省时省力、提高检查效率等优点，特别适合大量样品的快速检测。

附图说明