[发明专利]细菌透明质酸酶及其制备方法

权利要求书

1.制备源自Streptomyces koganeiensis ATCC 31394的具有如SEQ ID No.21所示的氨基酸序列的透明质酸酶的方法，包括以下步骤：

a)将细菌培养基与含有至少一种载体的重组细胞的接种物一起接种到生物反应器中，所述载体包含具有如SEQ ID No.41所示的核苷酸序列的核酸；

b)在存在营养液的条件下，使步骤a)的所述生物反应器的内容物在pH为6.7至7.1之间经历发酵；

c)向步骤b)的混合物中加入lac基因的诱导物；

d)使步骤c)的混合物经历8至24小时的诱导期；

e)将在步骤d)中获得的细菌细胞离心；

f)重悬浮在步骤e)中获得的沉淀物并使所得的悬液经历渗压震扰；

g)通过离心步骤f)的悬液来提取周质蛋白；

h)通过如下顺序来纯化在步骤g)中获得的具有透明质酸酶酶促活性的蛋白流分：

i.强离子交换色谱并分离透明质酸酶酶促活性流分；

ii.弱阳离子交换色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分；以及

iii.芳香疏水相互作用色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分，

其中，所述步骤a)的重组细胞选自大肠杆菌的细胞和枯草芽胞杆菌的细胞，

源自Streptomyces koganeiensis ATCC 31394的具有如SEQ ID No.21所示的氨基酸序列的所述透明质酸酶为纯化形式的重组透明质酸酶，其不含半胱氨酸，并且

步骤h)之后获得的所述透明质酸酶酶促活性流分中所述透明质酸酶的纯度为99％，并且内毒素含量小于0.5U/mg。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤b)中，使用甘油溶液作为营养液。