[发明专利]用于制备具有可分选精子的动物的遗传技术

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2013年5月31日提交的美国临时申请号61/829,672和2013 年8月27日提交的美国临时申请号61/870,586的优先权，其各自通过提述 并入本文。

政府支持声明

本文所述工作的方面由USDA-美国国立粮食和农业研究所(National InstituteofFoodandAgriculture)的生物技术风险评估项目竞争性基金号 2012-33522-19766支持。美国政府可以拥有这些发明的某些权利。

技术领域

本技术领域涉及遗传修饰的动物，特别是具有经遗传修饰用于通过性别 分选的精子的动物。

发明背景

如果能够对精子预分选，来从那些具有X染色体配子的精子挑选出具有 Y染色体配子的精子，动物育种和饲养活动将得到改进。接着可以从具有预 先确定性别的精子创造动物。

发明概述

提供了具有可容易分选的精子的建立者动物(Founderanimals)。所述精 子适合用于有效的离体分选过程。实施方案包括使用标志物标记的精子。所 述标记物提供可视化和/或用于结合的标签。提供阳性和阴性选择两者。使 用所述精子的离体分选过程包括，例如，基于可视化，基于标志物的分选， 阴性选择，例如，使用毒素或基于运动性的试验的技术。以下专利申请通过 提述在此并入本文用于所有目的：在冲突的情况下，以本说明书为准：US 2010/0146655,US2010/0105140,US2011/0059160,和US2011/0197290。

附图简述

图1说明了利用遗传工具来创建具有经遗传修饰的精子的动物。

图2A说明了具有精子外部和/或内部的经修饰的位点的哺乳动物精子。

图2B说明了用于分选精子的实施方案，其使用具有结合精子表面上的 标志物的配体的固相。

图3描述了创建具有标记来指示性别的精子的动物。

图4描述了修饰脊椎动物Y染色体的实验结果。

图5是实施例6和7的实验结果的剪辑组合(montage)，示出了 CRIPR/Cas9介导的HDR用于将来自疣猪的p65S531P突变基因渗入到常规 的猪中。组a)S531P错义突变；组b)对转染的Landrace成纤维细胞的 SURVEYOR试验；组c和d)示出了对第3天和第10天取样的细胞的RELP 分析。组a中顶部和底部的序列行为向导RNA(gRNA)(具有SEQIDNO: 1的P65_G1S和具有SEQIDNO:2的P65_G2A)。第二行为野生型(Wt) P65序列，SEQIDNO:3。第三行为实验中使用的HDR模板，SEQIDNO:4。 示出了左TALEN(SEQIDNO:5)和右TALEN(SEQIDNO:6)。

图6是实验结果的剪辑组合，示出了在猪APC中TALENs和 CRISPR/Cas9介导的HDR的比较。组a)描述了APC14.2TALENs和相对 于野生型APC序列的gRNA序列APC14.2Gla。下方，示出了HDR寡聚物， 其递送4bp插入(下划线文本)产生新的Hindlll位点。组b)示出了展示 RFLP和SURVEYOR试验结果的图。组a的顶行是APC14.2TALENs序列， SEQIDNO:7。第二行是野生型APCS序列，SEQIDNO:8。第三行示出了 gRNA序列Gla，SEQIDNO:9。底部序列是HDR模板，SEQIDNO:10。

图7示出了使用TALENs和质粒同源模板，基因靶向脊椎动物Y染色 体两个位点(AMELY和SRY)。使用同源臂外的基因座特异性引物和同源 模板内的转基因特异性引物筛选集落个体。所述同源模板的基因座和方向在 它们对应的孔上指示而阳性对照指示为(+)。

图8表格示出了使用TALENs和质粒同源基因盒的克隆中Y靶向的分 析结果。

图9是泛素EGFP对Y染色体中的3个位点的短同源靶向。针对SRY 的3’接合的引物也给出了有和无TALENs的非特异性条带模式。

图10柱状图示出了使用TALENs和对AMELY和SRY位点特异性的短 同源模板处理的细胞中EGFP标志物的表达。