[发明专利]通过代谢工程化的酵母菌株调节由玉米生产乙醇期间的氮代谢的方法

说明书

背景技术

能量转化、利用和获取成为我们时代的许多重大挑战的根本原因，包括与可持续性、环境质量、安全和贫困相关的那些。需要新兴技术的新应用以对这些挑战作出响应。生物技术，一种最有力的新兴技术，可产生重要的新能量转化工艺。植物生物质和其衍生物是将能量生物转化成对人类有用的形式的资源。

在植物生物质的形式中，基于粮食(grain)的生物质和木质纤维素生物质(统称为“生物质”)非常适于能源应用。每种原料具有优势和劣势。例如，因为其大规模可用性、低成本，和环境友好的生产，木质纤维素生物质作为用于生物燃料生产的可行的进料(feed)来源受到关注。特别地，基于纤维素生物质的许多能源生产和利用循环在生命周期的基础上具有接近零的温室气体排放。

然而，基于粮食的原料更容易通过现有的微生物转化成燃料，但是基于粮食的原料比木质纤维素原料更昂贵并且转化成燃料与用于粮食的供选择的用途竞争。

涉及酶或微生物水解的生物质加工方案通常涉及四种生物介导的转化：(1)产生糖解酶(纤维素酶和半纤维素酶)；(2)将预处理的生物质中存在的碳水化合物组分水解成糖；(3)己糖(例如葡萄糖、甘露糖和半乳糖)发酵；和(4)戊糖(例如，木糖和阿拉伯糖)发酵。这四种转化可发生在被称为联合生物加工(“CBP”)的工艺配置的单个步骤中，所述工艺配置与其他较不高度整合的配置的区别在于其不涉及用于纤维素酶和/或半纤维素酶生产的专用处理步骤。

CBP提供比特征为专用的纤维素酶生产的方法成本更低和效率更高的潜力。这些益处部分源自避免了与纤维素酶生产相关的资本成本、底物和其他原料和设备。另外，数个因素支持使用CBP实现更高的水解速率，并且因此实现减小的反应器体积和资本投资，所述因素包括酶-微生物协同作用和使用嗜热生物体和/或复杂的纤维素酶体系。而且，纤维素粘附性分解纤维素的微生物可能与非粘附性微生物成功地竞争纤维素水解的产物，例如污染物。期望的微生物的成功竞争增加基于微生物纤维素利用的工业过程的稳定性。开发实现CBP的微生物的进展通过下述两个策略来进行：工程化天然存在的分解纤维素的微生物，以改善产物相关的特性，如产率和效价；和工程化显示高产物产率和效价的非分解纤维素的生物体，以表达能够利用纤维素和半纤维素的异源纤维素酶和半纤维素酶体系。

符合乙醇生产需求的一种方式是转化生物质中存在的糖以产生乙醇，所述生物质即比如农业废物、玉米外壳、玉米芯、纤维素材料等的材料。大规模工业应用中有效的生物质转化需要能够耐受高浓度糖和乙醇的微生物，并且其能够同时发酵多于一种糖。

烘焙酵母(酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))是用于生产乙醇的优选微生物(B.等，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.73：53–84(2001))。有利于该微生物的属性是(i)接近理论产率的高产率(0.51g产生的乙醇/g使用的葡萄糖)，(ii)高渗透和乙醇耐受，(iii)工业过程中的天然稳健性，还有(iv)由于其与葡萄酒和面包制作以及啤酒酿造的长期关联而通常被视为安全的(GRAS)。此外，酿酒酵母显示对源自生物质预处理的水解产物中常见的抑制剂的耐受。产生乙醇的示例性代谢途径描绘在图1中。然而，酿酒酵母既不自发地分解纤维素的成分，也不有效地利用戊糖。

甘油是天然酵母乙醇发酵的代谢终产物(图1)。在碳水化合物上的厌氧生长期间，乙醇和二氧化碳的产生是氧化还原中性的，而产生细胞生物质和相关的二氧化碳的反应相对于碳水化合物更多是氧化的。相对于碳水化合物，甘油的产生更多是还原的，其用作电子冷阱，以抵消细胞生物质形成，以使总体氧化还原中性是守恒的。基于物质守恒的理论考虑这是必要的，并且在实践中不能产生甘油的菌株不能(或仅仅非常差地能够)在厌氧条件下生长。

有强的商业动机不产生作为副产物的甘油，因为其代表乙醇产率的损失。在工业玉米乙醇发酵中，对于～140亿加仑/年的市场，该产率损失可高达理论值的6％。以$2.50/加仑的销售价格，总市值为$2B/年。