[发明专利]一种基因联合检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种联合检测基因突变的方法，特别涉及一种以MLPA法为技术平台，同时检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因总共16种突变的方法。

背景技术

RAS基因包括KRAS、HRAS和NRAS三种，与肺癌相关的主要是KRAS基因，位于12号染色体上，编码P21蛋白，通过接受和传递细胞外生长刺激信号影响细胞内核酶等大生物分子合成，进而对细胞的生长和分化进行调控。当KRAS基因外显子2、3号发生突变时，突变的KRAS基因可以持续激活RAF-MEK-ERK-MAPK信号传导通路，导致细胞恶性增殖、分化及调控紊乱。在白血病、肺癌、大肠癌和胰腺癌等肿瘤中均发现了KRAS基因有较高的突变率。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)是一个重要的信号传导通路分子，由一个催化亚基p110和一个调节亚基p85构成。根据PI3K的p110结构特点和底物分子不同可将其分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等3个亚型。PI3K介导的信号转导通路在细胞的增殖、转化、凋亡和肿瘤的发生中起重要作用，调节肿瘤细胞的增殖和存活。研究发现，PI3K-AKT信号通路失调可导致肺癌、卵巢癌、乳癌、恶性胶质瘤、子宫内膜癌和鼻咽癌等恶性肿瘤的发生。

BRAF是人类最重要的原癌基因之一，大约8％的人类肿瘤发生BRAF突变。BRAF绝大部分突变发生在BRAF蛋白激酶激活区或其附近，其中约70％～90％是BRAF基因外显子15的第1799位核苷酸T突变为A，导致其编码的缬氨酸被谷氨酸取代(即BRAF V600E突变)。BRAF基因位于7号染色体，是细胞促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中的丝氨酸/苏氨酸激酶，一旦该基因表达改变，就会使生物学功能发生紊乱，从而使其介导的信号通路失调并最终导致细胞转化甚至恶变。

表皮生长因子受体(EGFR)是一种酪氨酸激酶受体(RTK)，位于第7号染色体，由28个外显子组成，编码1186个氨基酸，其糖蛋白分子量约170kDa。EGFR是I型酪氨酸激酶受体基因家族成员之一，是传递细胞外信号到细胞核内的重要途径蛋白。EGFR的主要信号转导途径有：RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路、PI3K-PDK通路、PLC-γ通路、JAK-STAT通路等。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。EGFR的突变主要发生在胞内TK区域的前四个外显子上(18～21)，目前发现的TK区域突变有30多种。其中外显子19的缺失突变(delE746-A750)和外显子21上的替代突变(L858R)又叫经典突变或热点突变，约占突变的90％。此外发生在外显子20上的替代突变T790M为耐药突变，在分子检测中同样具有重要的参考价值。

多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)是由Schouten等首先报道的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的多重检测技术。在MLPA反应中，扩增每个靶序列都需要一对探针，每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。这一对探针与靶序列进行杂交后，再用连接酶连接成为一条寡核苷酸链。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，也会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130～480bp之间。MLPA技术可用于多重检测，通过合理的探针设计，在一次反应中可以同时检测多个靶序列。在采用毛细管电泳对扩增产物进行分离、分析的情况下，同时检测的靶序列可达到45个。多重检测方法有利于提高检测效率，减少模板的使用量，尤其适用于模板量少且待测靶点较多的情况。如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。