[发明专利]一种基因联合检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基因联合检测方法，可同时检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因总共16种突变。

2.如权利要求1所述的基因联合检测方法，其特征在于，检测的突变包括：

KRAS基因突变：

PIK3CA基因突变：

BRAF基因突变：V600E(Cosmic ID 476)

EGFR基因突变：19号外显子的缺失突变、L858R(Cosmic ID 6224，c.2573T>G)和T790M(Cosmic ID 6240，c.2369C>T)。

3.如权利要求1所述的基因联合检测方法，其特征在于，包含了表1中P-SEQ-1～P-SEQ-34特异性探针。

4.一种基因联合检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述特异性探针。

5.如权利要求4所述的一种基因联合检测试剂盒，包括以下操作步骤：

模板变性：将模板DNA加入PCR管中，置于PCR仪上，设置温度为95～100℃，维持3～10min，再冷却至25℃；

杂交：在变性后的模板中加入MLPA Buffer和探针的混合物，其中探针的浓度为0.5～10nM；MLPA Buffer中含有Tris-HCl(50～500mM，pH8.2～9.0)，KCl(2～5M)，MgCl2(0.5～5M)，EDTA(0.5～5mM)；在PCR仪上运行杂交程序：95℃1min；60℃16～24h；

连接：杂交反应结束后，在每个PCR管中加入超纯水和连接酶，在PCR仪上运行连接程序：50～58℃10～30min；95～100℃10～30min；冷却至20℃；

PCR扩增：连接反应结束后进行PCR扩增，在每个PCR管中加入PCR通用引物、dNTPs和Taq酶，在PCR仪上运行PCR程序；

检测：可以采用琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺电泳及毛细管电泳等方法检测扩增的核酸片段。

6.如权利要求4所述的一种基因联合检测试剂盒，待检测样品包括新鲜病理组织、石蜡包埋病理组织、石蜡切片、唾液、痰液、尿液和血液。

7.一种用于检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因总共16种突变的探针，其特征在于，由P-SEQ-1～P-SEQ-34的寡核苷酸探针或序列与其有至少70％同一性的寡核苷酸组成。