[发明专利]转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测引物组和方法

权利要求书

1.转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测引物组，其特征在于：包括大豆内源基因lectin外引物、大豆内源基因lectin内引物、品系特异性RRS外引物、品系特异性RRS内引物、CaMV35S启动子外引物、CaMV35S启动子内引物、NOS终止子外引物、NOS终止子内引物、CP4-EPSPS外引物和CP4-EPSPS内引物，其核苷酸序列分别如下所示：

lectin外引物的上游引物：AGTCGTCGCTGTTGAGTTTGA；

lectin外引物的下游引物：ACCCACTCGGGAAGAGAAGTC；

lectin内引物的上游引物：TGCCTCCACCAGCCTCTT；

lectin内引物的下游引物：AGTCTTCAAATCGACCACATCG；

RRS外引物的上游引物：ACCAGTGACCCTAATAGGCAACA；

RRS外引物的下游引物：TGCGTGGTGAACTTTCTGTTGG；

RRS内引物的上游引物：ACCAGTGACCCTAATAGGCAACA；

RRS内引物的下游引物：AGTTCTTCTCCGATCCCAAATAG；

CaMV35S启动子外引物的上游引物：ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT；

CaMV35S启动子外引物的下游引物：CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT；

CaMV35S启动子内引物的上游引物：TCTCCACTGACGTAAGGGATGA；

CaMV35S启动子内引物的下游引物：GAAGGGTCTTGCGAAGGATAG；

NOS终止子外引物的上游引物：TGCCGGTCTTGCGATGA；

NOS终止子外引物的下游引物：AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC；

NOS终止子内引物的上游引物：TGCCGGTCTTGCGATGA；

NOS终止子内引物的下游引物：CCCATCTCATAAATAACGTCATGC；

CP4-EPSPS外引物的上游引物：GTTGCGGCCCTGCTTGT；

CP4-EPSPS外引物的下游引物：CAGCGTGGAGGAGCGAAC；

CP4-EPSPS内引物的上游引物：CCGACATCGAAGTCATCAACC；

CP4-EPSPS内引物的下游引物：CAGCGTGGAGGAGCGAAC。

2.转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于包括以下成分：

(1)引物液：含有引物液1、引物液2、引物液3、引物液4、引物液5、引物液6，含有权利要求1的检测引物组；其中，引物液1为各个基因外引物的混合液，各个基因外引物的终浓度均为5～20μmol/L；引物液2是lectin内引物，浓度均为5～20μmol/L；引物液3是RRS内引物，浓度均为5～20μmol/L；引物液4是CaMV35S启动子内引物，浓度均为5～20μmol/L；引物液5是NOS终止子内引物，浓度均为5～20μmol/L；引物液6是CP4-EPSPS内引物，浓度均为5～20μmol/L；

(2)反应液：有两种反应液：A溶液和B溶液；分别用于第一轮多重PCR扩增和第二轮荧光定量PCR扩增；其中，A溶液用于第一轮多重PCR扩增，内含有10mmol/L dNTPs、10×PCR Buffer反应缓冲液、150mmol/L MgSO₄，三者的体积比是(7～9):(4～6):(1～3)；B溶液用于第二轮荧光定量PCR扩增，内含有10mmol/L dNTPs、10×PCR Buffer反应缓冲液、150mmol/L MgSO₄、20×SYBR Green I，四者的体积比为(7～9):(4～6):(1～3):(0.4～2)；

(3)DNA聚合酶：浓度为4～6U/μL；

(4)对照：阳性对照为转基因大豆GTS 40-3-2的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的引物液1中各个基因的外引物浓度均为10μmol/L。