[发明专利]大肠杆菌热敏感毒素突变体LTm的体外制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地讲，涉及一种大肠杆菌热敏感毒素突变体LTm的体外制备方法。

背景技术

各种传染病的不断发生，对现有的疫苗提出了新的挑战。比传统注射疫苗更加的方便、快捷的粘膜免疫疫苗，已成为目前国内研究的新方向。而安全有效的粘膜免疫佐剂正成为粘膜免疫疫苗制备的关键。

皮肤、粘膜是机体抵抗外界感染的第一道防线，皮肤主要通过物理隔绝的方式来行使其保护功能，而粘膜除了物理隔绝作用外，还通过与之相关的淋巴组织，对外来物病原体生相应的应答，行使免疫作用。临床上，大约有70％以上的细菌、病毒和寄生虫都是通过粘膜入侵机体，引发疾病。

传统的免疫方式(如肌肉、皮下及皮内注射)能够诱发全身的免疫应答，却不能产生有效的粘膜的局部免疫应答，不能有效控制粘膜感染。为加强局部粘膜免疫，激活粘膜免疫应答，使疫苗发挥最大作用，通过粘膜进行接种就显得十分重要。与传统的注射疫苗相比，粘膜疫苗的接种途径与应用方法更为简便、快捷。粘膜疫苗可通过口服和气雾、点睛、滴鼻等方式导入机体，易于让病人接受，避免了注射引起的强烈刺激和伤口感染；不需专业医护人员的操作，便于大规模接种。更重要的是粘膜疫苗可以通过诱导粘膜和全身的免疫应答来提高疫苗的免疫效果。粘膜免疫可以诱导局部粘膜产生分泌性IgA(sIgA)、IgM和IgG等保护性抗体，并且可以诱导其它部位的粘膜也产生sIgA，这是粘膜免疫保护作用的主要机制。此外，粘膜免疫还诱导粘膜CTL反应，产生分泌IFN-γ的CD4+T细胞，这对于病原体侵入的预防和清除是非常重要的。

现有的研究表明，绝大多数非复合抗原，如：纯蛋白质抗原经粘膜递送时免疫原性较弱，持续时间短，尤其是口服途径，只有大量和反复接种后才可能引起免疫应答，难以取得理想的免疫保护效果，有时还会引起免疫耐受。寻找能够增强疫苗粘膜免疫原性的粘膜佐剂就成为粘膜疫苗开发中的关键问题。粘膜疫苗通过粘膜佐剂的辅佐与增强作用，才能获得持久的粘膜免疫应答，粘膜佐剂的辅佐是抗原激起粘膜免疫应答的一个重要条件。

大肠杆菌热敏肠毒素(Heat-labile Enterotoxin,LT)是肠毒性大肠杆菌(Enterotoxic Escherichia coli,ETEC)产生的一种毒素，能够引起人和其它哺乳动物的水样腹泻。除了毒性之外，LT全毒素以及分别的LTA、LTB亚基能有效启动局部免疫及全身的体液免疫和细胞免疫，可以显著增强宿主特异性免疫应答，是一种潜在的粘膜免疫佐剂。研究发现，通过定点突变技术，改变某些位点氨基酸可达到降低LT毒性的目的，使其真正能够应用于临床实践中。通过突变技术获得的一系列减毒、低毒突变体LTm，不仅降低了LT的毒性、而且还保留了其强有力的佐剂功能，在细胞实验、动物实验以及临床实验中都取得了良好的效果。因此，采用基因工程技术高效制备减毒且可作为粘膜免疫佐剂的LT突变体LTm及其亚基已成为国内外研究普遍追求的目标。

编码LT的基因全长1149bp，位于野生型产毒性大肠杆菌的质粒上。该基因包括LTA信号肽(18个氨基酸)的基因54bp、编码LTA(240个氨基酸)的基因720bp、编码LTB信号肽(21个氨基酸)的基因63bp及编码LTB(103个氨基酸)的基因309bp。在编码LTA的基因末尾与编码LTB信号肽基因开头处有一个4bp的重叠阅读框，二者以共转录的方式形成mRNA。