[发明专利]一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用。

背景技术：

1,3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料，有多种重要用途。它可用来合成杂环、药物中间体、聚酯、润滑剂、染料、油墨、防冻剂等，其主要用途是合成聚酯-聚对苯二甲酸丙二醇脂(PTT)。PTT是继50年代聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、70年代聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)之后实现工业规模的新的可成纤聚酯高分子材料，是一种极有发展前途的新型聚酯材料。1998年PTT被美国评为六大石化新产品之一。PTT与PET、PBT相比除具有聚酯的耐化学性外，还具有其它一些更优良的特性。如尼龙的弹性恢复性；在全范围无需添加特殊化学药品即能呈现良好的连续印染特性；抗紫外、臭氧和氮氧化合物的着色性；抗内应力；低水吸附、低静电以及良好的可生物降解性；可循环利用性等。由于PTT的具有以上优良特性，它在地毯工业、服装材料、工程热塑料以及其它众多领域有着很广泛的应用。

Dupont和Shell两家跨国公司曾采用化学合成路线，以环氧乙烷或丙烯为原料生产PDO。化学合成法生产PDO的缺点是副产物多，选择性和产率较低，操作条件需要高温高压，设备投资巨大，原料不可再生；同时由于产量有限，长期以来PDO售价偏高。目前1,3-丙二醇的生产方法主要是微生物发酵法。与化学合成法相比，微生物发酵法生产1,3-丙二醇具有显著的优点：1、利用成本较低的可再生资源(如甘油、玉米、淀粉)为原料；2、生产条件温和，操作简便，不需贵重金属催化剂；3、选择性好，副产物较少，易于分离纯化；4、环境污染小。微生物发酵法是以生物技术为特征的“绿色工业”向传统石油化工提出的强有力的挑战，具有重要的现实意义，因而越来越受到重视。

微生物发酵法生产1,3-丙二醇是利用微生物歧化甘油产生。至今所有被发现的1,3-丙二醇生产菌种均为细菌，其中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freudii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)具有较高的1,3-丙二醇转化率和1,3-丙二醇生产强度，具有较高的开发前景，从而得到了较多关注。

目前被用来生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌主要分离自土壤环境中。克雷伯氏菌只能利用甘油产生1,3-丙二醇。在发酵产生1,3-丙二醇的过程中，甘油发生岐化反应。还原途径包括两步反应：第一步，由依赖于辅酶B₁₂的甘油脱水酶催化甘油脱水生成3-羟基丙醛；第二步，由1,3-丙二醇氧化还原酶催化3-羟基丙醛还原生成1,3-丙二醇，此过程消耗1摩尔还原力。还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1,3-丙二醇。氧化途径中的产物与糖类发酵产物一致，并产生供细胞生长所必需的ATP，在氧化产物形成的同时释放还原力NADH。氧化途径中甘油先被氧化生成丙酮酸；丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰CoA和甲酸，甲酸容易分解为CO₂和H₂。乙酰CoA在经乙酰磷酸形成乙酸的过程中生成过量的ATP，而在经乙醛形成乙醇的反应中要消耗2摩尔还原力；丙酮酸也可能转化为2,3-丁二醇,乳酸和琥珀酸，生成乳酸的过程要消耗1摩尔还原力，而生成琥珀酸的过程要消耗2摩尔还原力。

克雷伯氏菌发酵甘油产生1,3-丙二醇，从代谢途径分析可知，甘油被转化为主产物1,3-丙二醇的同时，产生多种副产物：甲酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、2,3-丁二醇和乙醇等。副产物有机酸往往对发酵产生抑制作用。有文献报道甲酸、乙酸、乳酸等对微生物菌体生长及利用底物存在抑制作用。甲酸抑制作用大于乙酸，1g/L甲酸即明显抑制底物利用及菌体生长，2g/L乙酸开始对发酵产生较明显影响，而乳酸的抑制浓度较高。甲酸可能对克雷伯氏菌发酵甘油产生1,3-丙二醇产生抑制作用。副产物有机酸的生成不但抑制细胞生长，还会造成底物甘油的浪费。例如，乳酸的产生导致1,3-丙二醇产量降低。研究报道敲除乳酸代谢途径关键编码基因乳酸脱氢酶基因，可以使乳酸合成大幅度减少，1,3-丙二醇生产能力得到增强。

发明内容：

本发明的目的是提供一种生产1,3-丙二醇的工程菌—敲除甲酸代谢途径基因的工程菌及其构建方法和应用。

本发明的敲除甲酸代谢途径基因的工程菌，是通过以下方法构建的，将产1，3-丙二醇的野生型菌株的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因敲除后获得的工程菌。