[发明专利]焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的引物对及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的引物对，包含所述引物对的试剂盒及该试剂盒的应用。

背景技术

棘皮动物微管相关类蛋白4(echinoderm microtubule-associated protein-like4，EML4)与间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)融合基因与2007年被日本学者发现存在于部分非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，EML4-ALK融合基因在NSCLC中的阳性率约为3％-4％左右。EML4-ALK融合基因包括多种变异体(variants)，其中变异体1(variant 1或V1)和变异体3(variant 3或V3)的检出率最高。同时，EML4-ALK抑制剂为肺癌的个性化治疗提供了新的途径。

当前国内外广泛使用的分子生物学检测EML4-ALK融合基因的方法中，荧光原位杂交技术(FISH)操作复杂，而且不能区分不同的变异体；荧光定量PCR存在着检测通量的局限性和假阳性的缺点，所以都还不能真正满足临床诊断检测的需要。传统的固相生物芯片(Biochip)或基因芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的突出弱点。

焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为高通量、低成本、快速、直观地进行核苷酸分析和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的引物对以及含有所述引物对的试剂盒，可以同时检测EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3两种融合基因，具有高灵敏度、高特异性、高准确度、检测迅速等优点。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出了一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的引物对，所述的EML4-ALK为EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3中的任意一种或两种，其特征在于，所述引物对包括：

(1)对于EML4-ALK variant 1基因，

扩增引物为： 

上游引物：5′-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3′，

下游引物：5′-CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3′，

其中下游引物的5′端进行生物素标记；

测序引物为： 

5′-TGGGAAAGGACCTAAA-3′；

(2)对于EML4-ALK variant 3基因：

扩增引物为： 

上游引物：5′-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3′，

下游引物：5′-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3′，

其中上游引物的5′端进行生物素标记；

测序引物： 

5′-GTGCTTCCGGCGGTA-3′。

本发明进一步提出了一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的试剂盒，所述的EML4-ALK为EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3中的任意一种或两种，其特征在于，所述试剂盒包含质控品和如下引物：

(1)对于EML4-ALK variant 1基因，

扩增引物为： 

上游引物：5′-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3′，

下游引物：5′-CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3′，

其中下游引物的5′端进行生物素标记；

测序引物为： 

5′-TGGGAAAGGACCTAAA-3′；

(2)对于EML4-ALK variant 3基因：

扩增引物为： 

上游引物：5′-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3′，

下游引物：5′-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3′，

其中上游引物的5′端进行生物素标记；

测序引物： 

5′-GTGCTTCCGGCGGTA-3′。