[发明专利]一种提高α-淀粉酶表达量的通用型枯草芽胞杆菌整合表达载体

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种通用型的枯草芽胞杆菌整合表达载体，特别适用于提高α-淀粉酶表达量的枯草芽胞杆菌整合表达载体。

背景技术

枯草芽胞杆菌（Bacillussubtilis）属于革兰氏阳性菌，是一种非致病性的重要工业微生物。其全基因组测序工作已经完成。人们对其遗传背景和生理特性的了解仅次于大肠杆菌。利用枯草芽胞杆菌表达外源蛋白具有诸多优点：（1）安全性高，可用于食品、药物等工业生产；（2）能直接将分泌蛋白释放到培养基中，利于分离纯化；（3）具有高效的分泌目的蛋白的能力，其分泌的真核来源的重组蛋白多数情况下依然能够保持天然构象和生物活性；（4）生长迅速，培养条件简单，遗传背景了解清晰，具有较好的工业生产基础。

α-淀粉酶（α-amylase，EC3.2.1.1），也称液化型淀粉酶，是以糖原或者淀粉为底物，从分子内部切开α-1，4糖苷键，产物为糊精，含四个以上葡萄糖残基的低聚糖及少量的葡萄糖和麦芽糖。长期以来，α-淀粉酶一直被广泛应用于包括淀粉液化、纺织物退浆、酿造及焙烤等领域。

利用野生型枯草芽胞杆菌表达系统生产α-淀粉酶通常产量很低，这是由于α-淀粉酶在蛋白转运与分泌过程中存在很多瓶颈，一方面当细胞中涉及蛋白转运的调控元件不能满足需求时，会造成α-淀粉酶在蛋白转运过程中不能及时的被转运到合适的细胞部位而被细胞内蛋白酶降解，另一方面细胞中涉及蛋白分泌的限制性因子缺乏时，影响α-淀粉酶在分泌过程中的正确折叠，从而造成α-淀粉酶在胞壁间被蛋白酶所降解。因此通过在枯草芽胞杆菌中增加涉及蛋白表达分泌的各种限制性调控因子，将有利于α-淀粉酶表达分泌量的提升。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通用型的枯草芽胞杆菌基因组整合型表达载体，该载体通过将各种可能涉及外源蛋白表达分泌瓶颈的限制性因子通过同源重组整合到枯草芽胞杆菌染色体amyE基因上，能够大幅度提高外源蛋白尤其是α-淀粉酶的表达水平。

本发明的所述的质粒载体，包含有：

枯草芽胞杆菌的grac启动子序列，其核苷酸序列为SEQIDNO:1。

用于插入外源基因片段的多克隆位点MCS，其核苷酸序列为SEQIDNO:2。

用于整合amyE位点的基因5’和3’同源臂序列，其核苷酸序列分别为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。

本发明的载体，还包含有大肠杆菌复制子以及氯霉素抗性基因编码序列。

本发明的载体，其遗传图谱如图2所示，核苷酸序列为SEQIDNO:5。

本发明涉及的过表达调控元件PrsA，其核苷酸序列为SEQIDNO:6。

本发明中的具体实施例3中的质粒，其遗传图谱如图3所示，核苷酸序列为SEQIDNO:7。

本发明中的的具体实施例4中的各种调控元件SecA、SecDF、SecG、Ffh、SipU、SipV、SipW的核苷酸序列为SEQIDNO8-14。

本发明构建的整合载体用于在枯草芽胞杆菌（例如B.subtilis168，WB600，WB700，WB800，1A751，DB104等）中提高外源蛋白特别是α-淀粉酶的表达水平。

本发明构建的表达载体，能够通过同源重组的方式特异性整合到枯草芽胞杆菌染色体的amyE基因位置上，通过在细胞中过量表达各种可能涉及外源蛋白表达分泌瓶颈的限制性因子，提高外源蛋白尤其是α-淀粉酶在枯草芽胞杆菌中的转运水平或者促进蛋白的正确折叠，从而大幅度提高外源蛋白尤其是α-淀粉酶在培养基中的分泌水平。

附图说明：

图1：本发明的质粒载体pPgrac-MCS的构建示意图；

图2：本发明的质粒载体pPgrac-MCS的遗传图谱；

图3：实施例3中pPgrac-PrsA的遗传图谱；

图4：实施例3中的菌落PCR验证图；其中：M.TIANGENDNAMarkerⅢ；1.菌落PCR结果；2.阳性对照；

图5：实施例3中发酵液上清的SDS-PAGE电泳图：其中：M.PageRuler^TMPrestainedProteinLadder；1.1A751发酵液上清；2.1A751（amyE::Pgrac-PrsA）发酵液上清；3.pMA5-AmyL(1A751)发酵液上清；

4.pMA5-AmyL(1A751(amyE::Pgrac-PrsA))发酵液上清。

具体实施方式