[发明专利]检测犬弓形虫IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明为检测犬弓形虫IgM抗体的试剂盒，属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种犬弓形虫传染性疾病中检测抗体IgM的ELISA试剂盒及其制备方法。

背景技术

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种世界性分布的致病原虫，为细胞内寄生的原虫，有多种冷血和温血动物都会通过不同形式感染，包括54种哺乳动物，70种鸟类，5种爬虫类，传染途径主要是摄取被猫科和犬科动物的体液或粪便污染过的食物。

健康正常人感染弓形虫后多呈无症状带虫免疫状态，但特殊人群感染后常引起严重后果，如孕妇感染后，经母婴垂直传播可致胎儿先天性畸形、流产和死胎；感染弓形虫后体内的免疫系统最先分泌IgM抗体，对疑似感染的生物进行IgM抗体的检查更有利于早诊断，早治疗的原则。

弓形虫体表面还有多种表面抗原，可诱导宿主产生保护性免疫反应，P22表面抗原是弓形虫的主要表面抗原之一。

发明内容

本发明公开了一种检测犬弓形虫IgM抗体的基于捕获法ELISA方法的试剂盒及其制备方法，可用于弓形虫IgM抗体的大量筛查。

本发明还提供了一种采用基因重组技术，体外诱导表达、纯化P22抗原；采用过碘酸钠法对上述纯化蛋白进行辣根过氧化物酶标记。

本发明的目的是以原核表达的重组蛋白为基础，通过酶联免疫技术研制一种检测犬弓形虫IgM抗体的间接ELISA试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测犬弓形虫IgM抗体的捕获法ELISA试剂盒，所述的试剂盒包括由辣根过氧化物酶标记的P22蛋白。

还包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、酶标示踪物、酶标试剂、阳性对照、阴性对照。

上述用于检测犬弓形虫IgM抗体的捕获法ELISA试剂盒包括：

所述ELISA板条：每个试剂盒装有1块ELISA微孔板，每块ELISA板条为可自行拆卸的已包被抗原蛋白的ELISA微孔板，包被抗原蛋白为羊抗犬IgM，规格为8孔×12条；

所述ELISA微孔板的体积为300μl；

所述血清稀释液为即用型的牛血清白蛋白溶液；

所述洗涤液为25倍浓缩的磷酸盐缓冲液，使用前稀释；

所述底物显色液：即用型TMB显色液，10mL；

所述终止液：2mol/L的H₂SO₄溶液，10mL；

所述酶标试剂：所述辣根过氧化物酶标记的重组蛋白P22，使用前100倍稀释；

所述阳性对照为：经高温灭活的经疫苗免疫后一周内犬血清稀释液。

所述阴性对照为：经高温灭活的未患病且未经疫苗免疫的犬血清稀释液。

所述的捕获法ELISA试剂盒在检测犬弓形虫IgM抗体中的应用。

本发明是针对IgM抗体进行的检测，可以对弓形虫的早期感染进行检测，试剂盒可用于大批样品的筛查，试剂盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的技术方案如下：

一、抗原制备

1.弓形虫P22蛋白的表达

根据GenBank中弓形虫P22基因序列，设计合成了1对引物，采用PCR方法从DNA中扩增出P22基因片段，将其克隆到表达载体pET28b中，构建了重组质粒pET-P22，测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。

2.弓形虫P22蛋白的纯化

诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用PBS洗涤重悬菌体，超声裂解(超声1s，间隔1s，共10min)，12000rpm离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。蛋白纯化时使用镍离子亲和层析柱，纯化后，经SDS-PAGE、western blotting鉴定，获取到单一条带，并具备较好的抗原性。使用BCA法测定纯化后蛋白含量，纯化后P22蛋白的OD值为1.65，与标准品比较后，其浓度为1000μg/ml。

二、试剂盒的建立

1.本发明试剂盒的检测原理