[发明专利]一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及探针法实时-定量聚合酶链反应试剂盒，属于猪圆环病毒防治技术领域，具体说是一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，本发明还包括该试剂盒的使用方法。

背景技术

猪圆环病毒病是以2-型圆环病毒（Porcine circovirus type 2，PCV2）为主要病原、单独或继发/混合感染其它致病微生物的一系列疾病的总称。其感染与断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）的发生密切相关。致死率在1%～30%之间不等(Gillespie J, et al.,2009)，患病猪的主要临床表现为生长缓慢、体重减轻、呼吸困难、黄疸、腹泻、皮炎、淋巴结肿大、病毒血症和免疫抑制，容易继发感染如PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征)、PPV（猪细小病毒病）、猪肺炎支原体和猪链球菌等病原，造成机体多重感染。猪圆环病的感染呈世界性分布，已成为危害养猪业健康发展的重要病因之一。国外相继有猪圆环病毒的检测诊断试剂盒、但就目前市场供应的各种猪圆环病的抗原检测试剂盒，每头份价格在20～80元人民币之间，高昂的价格严重制约了猪圆环病实验室检测及流行病学的普查工作。目前应用相对较多的检测技术为常规的PCR方法，该方法可直接从猪的脾脏、全血、淋巴结及肉品等中扩增出预期的片断，但是结果的观察必须依赖于凝胶电泳，不但耗时长，而且凝胶中的溴化乙锭是一种强的致癌物，对操作人员的健康具有一定的危害；并且猪圆环病是一种具有高度传染性的病毒，其DNA（脱氧核糖核酸）特别容易发生变异。针对现有技术的不足，需要研制并开发出快速，敏感、准确以及价格低廉的猪圆环病毒检测试剂盒。

核酸探针具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱基互补序列的核酸片段结合，因此可用于样品中特定基因片段的检测。自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于 SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数同步进行，因此特异性强、灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。该技术是将常规PCR与荧光检测相结合的技术，不仅具有敏感性高、特异性强、用时短等优点，而且可通过分析软件对数据进行分析整理，结果更为准确直观，已成为病原体检测的重要方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术不能适应快速、敏感和准确定量的检测需求，从而提供一种能够快速、 敏感、准确地检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，本发明还提供该试剂盒的使用方法。

为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：

一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，所述试剂盒包含扩增预混液、阴性对照、阳性对照、序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物的混合物。

所述扩增引物序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2为：

SEQ ID NO:1：上游引物AAGCGGACCCCAACCACATAAA， 

SEQ ID NO:2：下游引物AGCGGGCACCCAAATACCACT。

所述探针引物序列为：

SEQ ID NO:3：GTGGGTGTTCACGCTGAATAATCCTTCCG。

所述扩增引物扩增出的条带序列为：

SEQ ID NO:4（218 bp）：

aagcggaccccaaccacataaaaggtgggtgttcacgctgaataatccttccgaagacgagcgcaagaaaatacgggagctcccaatctccctatttgattattttattgttgtcgaggagggtaatgaggaaggacgaacacctcacctccaggggttctctaattttgtgaagaagcaaacttttaataaagtgaagtggtatttgggtgcccgct。

所述阴性对照为无DNA酶水。

所述阳性对照为含有PCV2基因序列的阳性质粒pGM-218；其构建方式如下：