[发明专利]草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于靶DNA片断的检测技术领域，具体涉及一种利用反转录环介导等温扩增(reverse-transcription,Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)技术与荧光显色技术快速同时检测草鱼呼肠孤病毒三种基因型的试剂盒及检测方法。

背景技术

草鱼出血病病毒是中国分离的第一种鱼类病毒，隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属，直径70-80nm，20面体球形颗粒，含有11个片段的双链RNA，被定名为草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus，简称GCRV）。不同地区存在不同的毒株。目前已报道了10个分离株，该病毒主要引起中国淡水养殖主要品种草鱼在鱼种阶段发生出血病，死亡率高达90%以上，给水产养殖业造成巨大损失。目前己经报道了近20个分离株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV H962、ZV-8802、GCRV-854、GCRV HZ08、GCRV JX09-01、GCRV JX09-02、GCRV GD10、GCRV104株等，不同分离株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、对草鱼的致病力等方面差异较大。到目前为止，有报道的只有GCRV 873株、GCRV HZ08、GCRV GD10和GCRV104已完成全基因组序列分析，而其它毒株只完成了部分节段或者部分序列的测序工作。草鱼呼肠孤病毒比较复杂，不同分离株的各基因节段存在重配和抗原漂移现象，根据目前的研究，草鱼呼肠孤病毒根据基因分型，至少被分为三类：基因I型（代表株为873株），基因II型（代表株为HZ08株），基因III型（代表株为104株）。这三个基因型的草鱼呼肠孤病毒常常单独感染草鱼，也常出现混合感染的现象。

检测草鱼呼肠孤病毒的方法很多，有电镜观察法、细胞培养病毒分离法、病毒核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、免疫检测法、RT-PCR方法和RT-LAMP方法等。电镜观察法和细胞培养病毒分离法虽然经典，但是操作繁琐、花费时间长，并且不能区分草鱼呼肠孤病毒与其它病毒的感染；免疫学方法在敏感性和特异性上较差，并且存在空窗期、交叉反应、血清型差异等问题；RT-PCR方法，具有很大优势，但需要对扩增产物进行凝胶电泳，其中用到的核酸EB染料具有致癌性，对人造成潜在安全。RT-LAMP结合荧光染料建立的方法，与其它方法相比，简化了操作程序、降低了样品交叉污染，并且根据荧光信号强弱，可在检测过程中实时观察结果，通常20分钟以内就可判断结果，在操作性和时效性上具有巨大的优势。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒。本试剂盒包含了检测基因I型、基因II型、基因III型的草鱼呼肠孤病毒所必须的恒温扩增引物、荧光染料和其它优化的试剂组合。该试剂盒检测特异性强，敏感性高，检测时间短（最快15分钟可出结果），具有巨大的优势和创新性。

本发明的另一个目的在于提供一种利用草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法。本方法可以在60分钟内准确检测出样品中的三种基因型的草鱼呼肠孤病毒。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

所述的草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒，包括荧光反应液，反应酶,密封液，DEPC水，阳性对照和阴性对照。其特征在于所述的荧光反应液中含有用于检测草鱼呼肠孤病毒I型II型III型的恒温扩增用核酸引物组和荧光染料，该引物组包含引物GCRV1-FIP、引物GCRV1-BIP、引物GCRV1-F3、引物GCRV1-B3、引物GCRV1-LF、引物GCRV1-LB、引物GCRV2-FIP、引物GCRV2-BIP、引物GCRV2-F3、引物GCRV2-B3、引物GCRV2-LF、引物GCRV2-LB、引物GCRV3-FIP、引物GCRV3-BIP、引物GCRV3-F3、引物GCRV3-B3、引物GCRV3-LF、引物GCRV3-LB；

所述的引物GCRV1-FIP序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的引物GCRV1-BIP序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的引物GCRV1-F3序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的引物GCRV1-B3序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的引物GCRV1-LF序列如SEQ ID NO：5所示；