[发明专利]环介导等温扩增法检测B群链球菌的引物组及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种环介导等温扩增法检测B群链球菌的引物组及试剂盒。

背景技术

B群链球菌(Group B Streptococcus，GBS)，又称无乳链球菌，兼性厌氧，革兰阳性链球菌，正常寄居于阴道和肠道，属于条件致病菌。GBS感染引起肺炎、泌尿系统感染、软组织感染、败血症等。GBS可引起新生儿、孕妇和老年人感染，是新生儿败血症和脑膜炎最常见的病原菌，以新生儿感染率最高。成年人的B链球菌群感染多发生于机体抵抗力低下时。GBS寄居于母亲泌尿道和胃肠道的黏膜，孕妇带菌率4％～40％不等，可能在生产过程中传递给他们的孩子。20世纪70年代，GBS感染成为导致新生儿早期死亡的主要原因，死亡率高达50％。GBS感染的新生儿，幸存者中30％-50％有严重的神经系统后遗症，包括脑瘫、脑积水、发育障碍、智力障碍、听力或智力受损。GBS除了会造成新生儿感染外，怀孕妇女感染GBS会出现早产，早期破水、羊膜腔炎，产后子宫发炎，甚至流产、死产。GBS是围产期女性泌尿生殖道感染和新生儿期重症肺炎、败血症和脑膜炎的常见病原菌。新生儿的GBS感染具有发病迅速、病死率高的特点，是新生儿的主要死亡原因，已引起世界范围内广大学者的深切关注。对孕妇进行GBS筛查可及早发现感染，及时治疗，有效控制GBS的危害。

细菌培养是检测GBS的标准方法，但此菌营养要求较高，培养鉴定耗时较长，至少2d，且阳性率较低，给门诊就医患者带来不便，尤其不能满足孕检筛查的需要。如何在感染早期快速、准确、灵敏的检测GBS是临床诊断关注的要点。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种环介导等温扩增法检测B群链球菌的引物组及试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种环介导等温扩增法检测B群链球菌的引物组，包括，特异性外引物F3：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；特异性外引物B3：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；特异性内引物FIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；特异性内引物BIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

一种环介导等温扩增法检测B群链球菌的试剂盒，包括装有18μL反应液的反应管，装有10μL GBS DNA的阳性对照管，装有100μL无菌超纯水的阴性对照管，所述反应液内含反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、显色液、外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP；所述反应缓冲液各组分的浓度如下：400mM的Tris-Hcl，pH8.8；20mM的氯化钾；20mM的硫酸铵；16mM的硫酸镁和0.2％Tween₂₀、1.6M的甜菜碱、2.8mM×4种dNTP；Bst DNA聚合酶的活性含量为：160单位/18μL；显色液为：锰离子鳌和型钙黄绿素，0.001μmol/18μL；F3：4pmol/18μL，B3：4pmol/18μL；FIP：32pmol/18μL，BIP：32pmol/18μL。

所述试剂盒中装有18μL反应液的反应管为8个，装有10μL GBS DNA的阳性对照管1个，装有100μL无菌超纯水的阴性对照DNA管1个。

所述试剂盒内还含20个适配1-10μl移液器的Tip头。

上述试剂盒的使用方法：将2μL待检DNA加入反应管内，混匀，同时设阴性对照和阳性对照，阳性对照中加入GBS DNA，阴性对照中加入无菌超纯水，将反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：60-65℃水浴恒温反应30-40min，观察颜色变化。

本发明的有益效果：

1.本试剂盒针对GBS基因中高度保守、特异的cAMP基因设计引物，采用环介导等温扩增技术(LAMP)进行扩增并检测。因为扩增效率高，特异性好，对DNA质量和数量要求不高，DNA提取过程简单，不需要任何化学试剂，只需要沸水浴10min后离心即可，避免引入化学试剂对后续核酸扩增的影响，而且对仪器设备及操作要求低，简化了操作过程，降低了检测成本；

2.针对GBS基因中高度保守、特异的cAMP基因中的6个片段，自行设计并优选出特异性高、反应迅速、包含有4条引物的引物组，使得反应可在30-40min内完成；

3.将每个反应所需试剂预先混合并置于反应管中，检测时只需要在反应管中加入样本DNA即可进行反应，避免因多次加样带来的污染及误差，对操作人员要求低；而且试剂盒中包含取样所需移液器头(Tip头)，不需要另外准备耗材，进一步降低污染，提高检测的精确度和便捷度；