[发明专利]一种小反刍兽疫转基因植物疫苗高效表达载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程技术领域中的重组载体构建，特别涉及一种重组的用于预防小反刍兽疫的植物高效表达载体的构建。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des petits rμminants，PPR)是一种由小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Rμminants virμs,PPRV)引起的急性、接触性疫病，主要感染以山羊和绵羊等小反刍动物。该疫病的发病率和死亡率可高达100％和50％。对于该疫病目前尚无有效的治疗方法，因此要寻找有效的预防方法对该疫病进行预防。随着生物技术和基因工程技术的发展，对PPRV的研究也更为深入。PPRV基因组为单股负链RNA，从RNA链的3′端至5′端依次排列着N-P-M-F-H-L 6个基因，分别编码相应的6种结构蛋白。其中，F蛋白是组成病毒囊膜表面的一种纤突，属于融合蛋白，在病毒诱导的细胞病理学方面发挥着重要作用，是决定病毒感染成功与否的关键因素。Devireddy等发现纯PPRV的F蛋白具有生物学活性并且容易引起病毒引导性溶血，细胞融合和开始感染，具有免疫原性，这是本发明采用F蛋白基因作为目的基因的重要依据。

转基因植物可食疫苗利用分子生物学技术，将病原微生物的抗原编码基因转入植物，并在植物中表达出活性蛋白，人或动物食用含有该种抗原的转基因植物，会激发肠道免疫系统，从而产生对病毒、寄生虫等病原菌的免疫能力。

发明内容

本发明的目的在于：通过基因重组的方法将将F基因与植物表达载体pBI121连接，并且在其两侧加入调控序列使其能在植物中高效的表达。最终实现预防小反刍兽疫的目的。

本发明提供一种植物表达载体，其特征在于，包括PPRV中的F蛋白的F蛋白基因以及和该基因连接的重组质粒，共计五种，分别为：

pBI121-F，

121-C-F-M12-M34

121-C-FKDEL-M12-M34

121-C-G-F-M12-M34

121-C-G-FKDEL-M12-M34

其基因序列见序列表。

其中的F蛋白基因见序列表1。

本发明通过对pBI121植物表达载体的HindⅢ酶切位点到EcoR Ⅰ酶切位点处进行改造得到的,改造所需的基因或调控序列包括GFP、MAR12、MAR34、CsVMV、F、FKDEL，其对应的基因序列见序列表2-7。

本发明添加相关基因及序列后共改造4条载体，其添加的基因和调控序列依次排列顺序为：

MAR12-CsVMV-GFP-F-MAR34；

MAR12-CsVMV-GFP-FKDEL-MAR34；

MAR12-CsVMV-F-MAR34；

MAR12-CsVMV-FKDEL-MAR34。

本发明还提供本发明的植物表达载体的制备方法，所述方法，步骤如下：

步骤1，用引物提取相关质粒并进行PCR扩增，

步骤2，对PCR产物使用T/A克隆的方法连接到pUCM-T载体上，

步骤3，植物表达载体的构建。

优选的，所述方法，步骤如下：

步骤1、基因扩增，

MAR序列：以pMD-MAR质粒为模板，分别使用引物MAR12-F、MAR12-R和MAR34-F、MAR34-R进行克隆；

GFP序列：以pHL005为模板，以GFP-F、GFP-R为模板；

PPRV-F、F-KDEL序列:以PPRV-F为模板，分别以PPRV-F-F、PPRV-F-R和PPRV-F-F、PPRV-FKDEL-R为模板；

CsVMV序列：以合成的CsVMV为模板，以CsVMV-F、CsVMV-R为模板；

步骤2，将步骤1所得基因连接到pUCM-T载体上，所得质粒命名为：pGFP、pMAR12、pMAR34、pCsVMV、pF、pFKDEL。

步骤3，植物表达载体的构建：

1)、表达载体pBI121-CsVMV的构建

2)、表达载体pBI121-CsVMV-GFP的构建

3)、表达载体pBI121-CsVMV-GFP-Mar12的构建

4)、中间表达载体pUCM-GUS-GFP的构建

5)、中间表达载体的pUCM-GUS-GFP-MAR34的构建