[发明专利]一种小反刍兽疫转基因植物疫苗高效表达载体的构建方法

权利要求书

1.一种植物表达载体，其特征在于，包括PPRV中的F蛋白的F蛋白基因以及和该基因连接的重组质粒，共计五种，分别为：

pBI121-F，

121-C-F-M12-M34

121-C-FKDEL-M12-M34

121-C-G-F-M12-M34

121-C-G-FKDEL-M12-M34

其基因序列见序列表。

2.根据权利要求1所述的植物表达载体，其中的F蛋白基因见序列表1。

3.根据权利要求1所述的植物表达载体，通过对pBI121植物表达载体的HindⅢ酶切位点到EcoRⅠ酶切位点处进行改造得到的,改造所需的基因或调控序列包括GFP、MAR12、MAR34、CsVMV、F、FKDEL，其对应的基因序列见序列表。

4.根据权利要求3所述的植物表达载体，其中，添加相关基因及序列后共改造4条载体，其添加的基因和调控序列依次排列顺序为：

MAR12-CsVMV-GFP-F-MAR34；

MAR12-CsVMV-GFP-FKDEL-MAR34；

MAR12-CsVMV-F-MAR34；

MAR12-CsVMV-FKDEL-MAR34。

5.权利要求1所述的植物表达载体的制备方法，所述方法，步骤如下：

步骤1，用引物提取相关质粒并进行PCR扩增，

步骤2，对PCR产物使用T/A克隆的方法连接到pUCM-T载体上，

步骤3，植物表达载体的构建。

6.权利要求5所述的植物表达载体的制备方法，所述方法，步骤如下：

步骤1、基因扩增，

MAR序列：以pMD-MAR质粒为模板，分别使用引物MAR12-F、MAR12-R和MAR34-F、MAR34-R进行克隆；

GFP序列：以pHL005为模板，以GFP-F、GFP-R为模板；

PPRV-F、F-KDEL序列:以PPRV-F为模板，分别以PPRV-F-F、PPRV-F-R和PPRV-F-F、PPRV-FKDEL-R为模板；

CsVMV序列：以合成的CsVMV为模板，以CsVMV-F、CsVMV-R为模板；

步骤2，将步骤1所得基因连接到pUCM-T载体上，

所得质粒命名为：pGFP、pMAR12、pMAR34、pCsVMV、pF、pFKDEL，

步骤3，植物表达载体的构建：

1)、表达载体pBI121-CsVMV的构建

2)、表达载体pBI121-CsVMV-GFP的构建

3)、表达载体pBI121-CsVMV-GFP-Mar12的构建

4)、中间表达载体pUCM-GUS-GFP的构建

5)、中间表达载体的pUCM-GUS-GFP-MAR34的构建

6)、中间表达载体pUCM-F-GFP-MAR34和pUCM-FKDEL-GFP-MAR34的构建

7)、植物表达载体pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34和

pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34构建

8)、植物表达载体pBI121-CsVMV-F-MAR12-MAR34和

pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34构建

9)、植物表达载体pBI121-F的构建

向载体上连接上一个组件后就使用PCR验证的方法进行验证，验证所使用的引物一条pBI121载体上的一段序列一条为所连入的组件上的一段序列。