[发明专利]大麻DNA荧光复合扩增系统

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及大麻DNA荧光复合扩增系统。

背景技术

大麻为被子植物门荨麻目大麻科大麻属一年生雌雄异株草本植物。大麻属植物主要有栽培大麻(Cannabis sativa L)、印度大麻(Cannabis sativa L)和野生大麻(Cannabis ruderalis Janisch)3个品种，在长期的生物自然进化和人工培育过程中又产生了许多大麻变种和亚种。大麻具有悠久的栽培历史，是许多国家重要的经济作物，被用作纺织纤维、动物饲料、油料、药物和麻醉品。大麻具有至幻作用，能作用于神经系统，具有强烈的成瘾性和麻醉性，使人的神经由兴奋转为抑制，所以联合国公约将其列为与海洛因、可卡因并列的三大毒品之一。大麻至幻作用的有效成分包括大麻二酚(CBD)、大麻酚(CNB)和四氢大麻酚(THC)，其中起重要作用的是THC。通常根据THC和CBD的含量将大麻分为毒品型大麻(THC>0.5％,CBD<0.5％,即THC/CBD>1)、中间型大麻(THC>0.5％,CBD>0.5％)和纤维型大麻(THC<0.5％,CBD>0.5％,即THC/CBD<1)。虽然包括我国在内的许多国家均明文规定对大麻的种植等活动进行限制、管制、监察和检察等措施。然而在高额利润的驱使下，全球范围的毒品大麻种植和非法交易活动屡禁不止。与此同时，在大麻犯罪案件中缴获成批未加工的大麻植物(如整株植物、种子等)的情况也屡见不鲜。在法庭科学中，虽然可用传统的植物形态学方法和理化方法如常规化学法、毛细管电泳法、薄层色谱法等对大麻进行鉴定，但这些方法有很大的局限性，对检材的要求较高且不能进行有效的产地推断，所以为了实现法庭科学推断大麻来源的需要，尝试寻求新的更好的方法来解决这一问题。

近年来随着分子生物学的快速发展，用DNA检验技术对大麻进行分子水平的鉴定成为法庭科学研究的热点和新技术方法。

RAPD即随机扩增多态性DNA标记，是建立在PCR基础之上的一种可对整个未知序列基因组进行多态性分析的分子技术。它采用人工合成的含有9-10个碱基的随机序列组成的寡核酸做引物，通过PCR扩增获得长度不同的多态性DNA片断。RAPD形成的遗传基础是:在DNA等位区域内，因引物靶序列发生点突变，使扩增子(两个反向聚合的引物靶序列之间的DNA区域)丢失，产生显性的RAPD，或因扩增子内发生序列的插人、缺失突变，产生共显性的RAPD。个体的模板不同，其扩增产物就不同。在关于大麻的研究中，1995年Gillan和Cole等运用RAPD和HPLC两种方法对17株大麻标本进行检测，利用RAPD技术成功地对HPLC无法区分的大麻样本进行了鉴定。1996年，Jagadish等用RAPD技术成功区分了大麻和蛇麻草。Sakamoto等(1995年)、Mandolino等(1999年)及陈其军等(2001年)分别将用RAPD技术获得的RAPD分子标记转化为SCAR标记。研究证明RAPD可以对大麻进行有效的种属鉴定。但是由于RAPD方法对模板DNA要求较高，且随机引物的片段较短，扩增产物的稳定性和重复性欠佳，检测费用较高，费时费事，所以在法庭科学实际工作中很难作为常规检测方法，其一般被用于大麻遗传多样性的研究及特异性片段的筛查等工作中。

AFLP检测技术是RAPD和RFLP技术相结合的产物，该技术的原理是对基因组DNA限制性酶切片段进行选择性扩增，它具有多态性强、不需预先知道目标基因组序列、DNA模板浓度宽容度大、谱带清晰，实验稳定性好等优点。在关于大麻的研究中，2006年，Shannon L等利用AFLP分子标记对三个工业纤维大麻品种和一个高毒药用品种间的遗传差异进行检测，10对引物扩增检测出1206条普带，其中88％具有多态性，其中18条普带对工业发麻和高毒大麻具有鉴别意义。郭佳等用银染AFLP技术用55对引物组合对12个大麻地域品种进行初筛，选出了5对多态性好的引物组合，每对AFLP引物组合扩增出47～76条普带。AFLP技术存在操作繁琐，费时费力，不便进行数据统计和对比等不足，所以AFLP也一般被用于标记的筛查等。