[发明专利]一种鉴定或辅助鉴定细菌菌门的引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴定或辅助鉴定细菌菌门的引物及其应用。

背景技术

高通量测序作为近年来发展起来的全新的技术手段，在生态系统的研究中起到了非常重要的作用。随着测序技术的逐渐成熟和应用领域的扩大，其重要性日益突出。目前高通量测序已经被广泛应用于环境和人体肠道样本的微生物群落多样性和丰度的检测，主要包括土壤、动物体表和肠道样品等。

尽管高通量测序技术于近年得到广泛应用，但测序文库的构建方法仍没有明显的改进。测序文库的构建主要包括以下步骤：元基因组提取，基因组的片断化，DNA片断末端加A，然后加adaptor。之后利用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片断，最后对构建好的文库进行定量，定量合格的文库即可用于高通量测序。建库过程中涉及多个DNA片断筛选和磁珠纯化的步骤。该方法对于需要了解生态系统中菌群的多样性和丰度要求的样品并不适用，因为测序会产生大量不需要的冗余数据从而增加测序成本，而且以上的建库方法步骤繁琐而耗时。故开发步骤简单而覆盖率高的测序文库构建方法就显得尤为重要。

目前细菌的分子鉴定普遍采用16S rRNA基因作为金标准。菌种鉴定的常规步骤是利用细菌16S rRNA基因通用引物扩增该基因全长，测序后与数据库中的数据比对来鉴定菌种。目前使用高通量测序方法研究生态系统中菌群多样性和丰度的普遍采用的平台是焦磷酸测序(454pyrosequencing)，该方法准确率高但成本也很高，而且通量低。但目前采用Illumina平台构建文库时仅采用单一测序引物，无法覆盖大多数数据库中已知的细菌菌门，从而会丢失一部分没有覆盖到的菌门信息。因此设计高覆盖率的测序引物迫在眉睫。

发明内容

本发明的一个目的是提供一组用于鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门的引物。

本发明所提供的一组用于鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门的引物，由如下(1)-(7)所示引物组成：

(1)如SEQ ID No.1中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；

(2)如SEQ ID No.2中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；

(3)如SEQ ID No.3中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；

(4)如SEQ ID No.4中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；

(5)如SEQ ID No.5中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；

(6)如SEQ ID No.6中第59-75位核苷酸分子所示的反向引物；

(7)如SEQ ID No.7中第59-75位核苷酸分子所示的反向引物。

上述引物中，所述正向引物序列的5’端连接有adaptor序列。

上述引物中，所述正向引物序列的5’端连接的adaptor序列如SEQ ID No.1中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.2中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.3中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.4中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.5中第1-58位核苷酸分子所示。

上述引物中，所述反向引物序列的5’端连接有adaptor序列。

上述引物中，所述反向引物序列的5’端连接的adaptor序列如SEQ ID No.6中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No.7中第1-58位核苷酸分子所示。

上述引物中，所述反向引物中还包括barcode序列。

上述引物中，所述barcode序列加入的位置是反向引物中的adaptor序列的第24-25位核苷酸分子之间，不同的待测样品中加入不同的barcode序列。

本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌种的试剂盒。

上述所述试剂盒中包括上述任一所述的引物。

上述所述的试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门的产品中的应用也是本发明的目的。

本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门的方法。

本发明所提供的一种鉴定或辅助鉴定待测样品中细菌菌门的方法包括如下步骤：

(1)提取待测样品中细菌基因组DNA；

(2)以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，采用上述所述的引物进行多重PCR扩增，得到扩增产物；