[发明专利]一种酶活提高的胰蛋白酶突变体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶活提高的胰蛋白酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

胰蛋白酶作为丝氨酸蛋白酶中的较早被发现应用的一种重要类型，最早被发现于哺乳动物的肠道消化液中。商品化的胰蛋白酶多从哺乳动物胰脏提取，由于胰脏中含丰富的蛋白酶，对胰蛋白酶分离提纯带来困难。另外，哺乳动物来源的胰蛋白酶多为胰酶混合物，在医药应用上存在对人体的免疫原性危害。

灰色链霉菌胰蛋白酶研究，Koo-Bon-Joon等利用链霉菌常用宿主Streptomyces lividans1326及链霉菌常用的pWHM3质粒(Ermp，红霉素启动子)获得在同属菌中分泌表达的重组胰蛋白酶，Chi-Won-Jae等将此质粒转入到能够产胰蛋白酶的灰色链霉菌Streptomyces griseus IFO13350中表达，Daisuke Nohara等人(1998)将链霉菌胰蛋白酶以包涵体形式在E.coli系统中进行了表达。前期研究在毕赤酵母中以成熟胰蛋白酶形式表达了灰色链霉菌来源的胰蛋白酶。本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过选择特定氨基酸优化胰蛋白酶分子结构、提高酶活。

异源表达胰蛋白酶突出的问题是，蛋白表达量低、胰蛋白酶酶活低。因此，定点突变改造胰蛋白酶，提高胞外酶活，对于满足胰蛋白酶工业化成产需求和降低生产成本有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种酶活提高的胰蛋白酶突变体及其构建方法。

本发明提供一种酶活提高的胰蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述突变体的核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列。

所述突变体是在如序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将第1位的酪氨酸突变成了苯丙氨酸(Y1F)，同时将第123位的精氨酸突变成了异亮氨酸(R123I)。

前期研究工作中，本研究团队已获得一种产热稳定性胰蛋白酶的重组毕赤酵母工程菌，该酵母菌表达核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的胰蛋白酶。

所述编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列是SEQ ID NO.4所示的序列。

本发明还提供一种表达所述胰蛋白酶突变体的基因工程菌。

所述基因工程菌的制备方法，是在SEQ ID NO.4所示序列的基础上，将第123位的精氨酸突变成了异亮氨酸，得到突变体R123I，同时将第1位的酪氨酸突变成苯丙氨酸(以Y1F表示)，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到酵母宿主菌中即得到酵母基因工程菌。

所述表达载体是以下任意一种：pGAP ZA、pAO815、pGAPαA、pPIC9K、pPIC ZB。

所述表达载体，在本发明的一种实施方式中是pPIC9K。

所述酵母宿主菌是以下任意一种：pichiapastoris GS115、pichiapastoris KM71、pichia pastoris X-33、pichiapastoris SMD1168。

所述酵母宿主菌，在本发明的一种实施方式中是Pichiapastoris GS115。

所述的制备方法，具体是：

(1)以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，F1primer(序列如SEQ ID NO.5所示)、R1primer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR得到R123I突变体；

(2)以上一步得到的突变体的基因序列为模板，F2primer(序列如SEQ ID NO.7所示)、R2primer(序列如SEQ ID NO.8所示)为引物，进行PCR，即得到序列如SEQ ID NO.3所示的重组基因。

(3)将上一步得到的重组基因序列，连接到pPIC9K表达载体中，得到重组质粒pPIC9K-重组基因，重组质粒电转化Pichiapastoris GS115，获得重组酵母工程菌株，命名为FemiGS115。