[发明专利]产生γ-氨基丁酸的方法

说明书

本申请是发明人于2009年2月20日提交的题为“产生γ-氨基丁酸的方法”的中国专利申请200980105702.3的分案申请。

本发明涉及通过培养表达具有谷氨酸脱羧酶活性的酶的重组微生物发酵产生γ-氨基丁酸(GABA)的新方法。本发明还涉及对应的重组宿主、重组载体、适于制备此类宿主的表达盒和核酸以及利用发酵产生获得的GABA制备聚酰胺的方法。

背景技术

GABA(CAS号56-12-2)是在原核和真核生物中普遍存在的重要非蛋白质氨基酸。其显示不同的生物机能，例如交感神经系统中代表性的抑制性神经递质，并且其有效降低实验动物和人的血压。该化合物由谷氨酸脱羧酶(GAD；EC4.1.1.15)从谷氨酸合成。

GABA用于不同技术领域。例如，富含GABA的食品可用作食物添加物和营养剂来帮助治疗失眠、抑郁和自主神经系统障碍、慢性酒精中毒相关症状以及激活免疫细胞。该化合物还可用作生产聚酰胺和吡咯烷酮的原料。

发酵产生该具有商业价值的化合物的合适方法尚未有记载。

因此，本发明的目的是提供发酵产生GABA或其相应盐的合适方法。

附图说明

图1显示来自马铃薯EST的叠连群(contig)与来自植物的GAD同源物的比较。

图2显示本发明的嵌合GAD基因的示意图。

图3显示pClik5aMCS克隆载体的质粒图。

发明内容

通过本发明教导GABA或其盐的发酵产生解决了上述问题，该发酵生产通过培养表达GAD酶的重组谷氨酸产生微生物实现，该酶将该微生物中形成的谷氨酸转变为GABA。

具体实施方式

1.优选实施方案

本发明涉及发酵产生γ-氨基丁酸(GABA)的方法，该方法包括培养优选衍生自具有产生谷氨酸能力的亲本微生物的重组微生物，该重组微生物定性地或定量地保持该亲本微生物的该能力，还具有表达异源谷氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.15)的能力，由此谷氨酸转变为GABA；以及该方法任选地包括将GABA从发酵液中分离。该经修饰微生物还可以或可以不保持其产生谷氨酸的能力。

特别地，该微生物是谷氨酸产生细菌，特别是棒杆菌，例如棒杆菌属(Corynebacterium)的细菌，例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

该异源谷氨酸脱羧酶是原核或真核来源的。

在一个具体实施方案中，该异源谷氨酸脱羧酶是植物谷氨酸脱羧酶或嵌合谷氨酸脱羧酶，其包含至少一个来源于植物谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列部分。该“至少一个来源于植物谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列部分”包含该植物酶的至少十个连续氨基酸残基。总计，可能有1至10个，特别地，1至5个，优选1或2个的氨基酸序列部分来源于该植物序列。该部分的每一个可具有10至500、10至450、10至400、20至350、40至300、50至250、60至200、70至150或80至100个该植物酶的连续氨基酸残基。

特别地，该异源谷氨酸脱羧酶是茄属(Solanum)植物的脱羧酶，特别是马铃薯(Solanum tuberosum)，即土豆。例如，该异源谷氨酸脱羧酶来自马铃薯，包含SEQ ID NO:2的Thr94至Leu336的氨基酸序列，或者与其具有80％至小于100％同一性的序列，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

另外，该异源谷氨酸脱羧酶可以在N端和/或C-端添加来自马铃薯谷氨酸脱羧酶的对应末端氨基酸序列，或者在N端和/或C端添加不同于马铃薯的第二植物的谷氨酸脱羧酶的对应末端氨基酸序列。例如，该第二植物是番茄，即西红柿。

在一个特别实施方案中，该异源谷氨酸脱羧酶包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者与其具有80％至小于100％同一性的序列，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

根据本发明的另一个实施方案，该异源谷氨酸脱羧酶是细菌谷氨酸脱羧酶，例如来自埃希氏菌属(Escherichia)的细菌，特别是大肠杆菌(E.coli)。